謝 莉 艾買提江·阿依甫別克 徐 鴻 于新蘭

新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830054

菠菜來源于藜科菠菜屬植物菠菜SpinaciaoleraceaL，為藥食同源類植物，別名為波斯菜、赤根菜，系屬外來中藥資源，一般以其地上部分、果實(shí)和根入藥，現(xiàn)全國各地均有栽培[1-2]。菠菜子為菠菜的果實(shí)，又稱菠薐菜子，是維吾爾醫(yī)常用藥材，維吾爾語名為 Palek Urughi。主要用于異常膽液質(zhì)過剩、熱性傷寒、發(fā)燒不退、體弱、便秘、熱性心痛等疾病[3-4]。目前，菠菜子收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》維吾爾藥分冊(cè)中[5]，但該標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容簡(jiǎn)單，僅對(duì)菠菜子的性狀和顯微進(jìn)行簡(jiǎn)單描述，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏低，不足以控制本藥材的質(zhì)量?，F(xiàn)有研究報(bào)道多為原植物種植方法、組織形態(tài)和藥理作用等方面[6]，目前國內(nèi)文獻(xiàn)未見有關(guān)菠菜子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究報(bào)道。因此，為促進(jìn)中藥民族藥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，推動(dòng)民族藥材標(biāo)準(zhǔn)化提高，故本研究對(duì)菠菜子的性狀、TLC 鑒別、水分、總灰分、浸出物及含量測(cè)定項(xiàng)目進(jìn)行研究，以期為菠菜子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津(LC-20AT)高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器(日本島津公司)；JA 12002 型電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；SK7210LHC 型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；成像顯微鏡(日本 OLYMPUS 公司)；冷凍切片機(jī)( Thermo 公司)；GZX-9140MBE 型鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；DZKW-D-6 型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；KLZ-UP 型艾柯純水儀(臺(tái)灣艾柯，成都康寧試驗(yàn)專用純水設(shè)備廠)。

1.2 試藥 乙醇(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào) 20171008)；甲酸(分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號(hào) 20170703)；甲醇(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào) 2018101012)；硅膠 G 薄層板(青島海洋化工分廠，批號(hào) 20170812)；乙腈(Fisher 公司，Lot 18356)；磷酸(天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號(hào) 20160215)β-蛻皮甾酮對(duì)照品(批號(hào) H918750)購自于加拿大多倫多 Toronto Research Chemical(TRC) 公司。

菠菜子藥材從市場(chǎng)上收集，共計(jì)25批，產(chǎn)地分布于新疆和田、安徽亳州、山東臨沂、甘肅隴西、河北安國等地，藥材基源由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院蘇來曼·哈力克主任藥師進(jìn)行鑒定為圓葉菠菜的果實(shí)，樣品信息見表1。

表1 菠菜子藥材信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 菠菜子的外形與中藥蒺藜科蒺藜TribulusterrestrisL.干燥的果實(shí)外形相似，常被人混用[7]，目前常被視為蒺藜的偽品之一。故結(jié)合藥材實(shí)際性狀，本文對(duì)菠菜子性狀進(jìn)行了規(guī)范化的描述。菠菜子呈近或扁圓形，直徑 2～4 mm。表面淺綠色或灰白色，略粗糙，側(cè)面有 2～4個(gè)縱棱；一端圓形，中部有突起，另一端有稍尖的合點(diǎn)，帶有殘留的果柄或已脫落；果皮堅(jiān)硬，種皮深棕色、光滑有光澤，種臍部凹陷，具一環(huán)狀縱溝；胚乳類白色，粉性。無臭，味淡。如圖1所示。

圖1 菠菜子性狀

2.2 定性鑒別 菠菜子中含有黃酮類、甾體類等活性成分，其中甾體類活性成分分為植物甾醇類和昆蟲蛻皮激素等，植物甾醇主要含 α-菠菜甾醇、Δ7-豆甾烯醇、β-谷甾醇、蛻皮甾酮、羥基蛻皮激素等[8-10]，本試驗(yàn)為菠菜子中 β-蛻皮甾酮進(jìn)行定性鑒別，并對(duì)展開劑、顯色劑、展開環(huán)境等色譜條件進(jìn)行了考察。

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品粉末 3g，加 80% 甲醇 5 mL，超聲處理 20 min，靜置，取上清液，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取β-蛻皮甾酮對(duì)照品，加甲醇制成 1 mL含 0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.新疆和田；2.安徽亳州；3.山東臨沂；4. β-蛻皮甾酮；5.甘肅隴西；6.河南南陽；7.河北安國圖2 菠菜子供試品薄層色譜

2.2.3 薄層色譜條件 分別吸取供試品溶液 10 μL，對(duì)照品溶液 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，選取三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(8∶2∶0.3∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105 ℃ 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視，如圖2所示。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，可用于菠菜子中 β-蛻皮甾酮的鑒別。不同采集地樣品色譜基本一致，說明該方法可靠穩(wěn)定。

2.3 檢查 水分和總灰分測(cè)定分別參照《中國藥典》2015 年版四部通則 0832 (第二法)和 2302 進(jìn)行試驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見表 2。根據(jù)測(cè)定結(jié)果可得，樣品水分在 5.76%～10.06% 范圍內(nèi)，為 (8.37±1.37)%(n=25)；樣品總灰分在 4.27%～5.41% 范圍內(nèi)，為 (4.65±0.27)%(n=25)，在各批次樣品測(cè)定值的基礎(chǔ)上上浮 20%，作為各指標(biāo)的上限，暫定菠菜子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中水分不得過 11.0%，總灰分不得過 6.0%。

2.4 浸出物 參照《中國藥典》 2015 年版四部中“藥材和飲片檢定通則( 0212 )”項(xiàng)下的浸出物測(cè)定法試驗(yàn)。選取稀乙醇為提取溶劑，采用冷浸法提取菠菜子樣品中的浸出測(cè)定結(jié)果見表3。

表2 水分、總灰分測(cè)定結(jié)果 (n=25)

表3 浸出物測(cè)定結(jié)果

由上表可知，樣品測(cè)定值范圍為6.65%～13.25%，實(shí)測(cè)值 (%) 為 (10.12±2.03)%(n=25)，在各批次樣品測(cè)定值的基礎(chǔ)上下浮 20%，作為各指標(biāo)的下限，暫定菠菜子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中浸出物不得低于 8.0%。

2.5 含量測(cè)定[11-14]

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ODS C18 (250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.02% 磷酸溶液(16∶84)，流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長：250 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.5.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取 β-蛻皮甾酮對(duì)照品 25.81 mg，置 20 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，定容，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取菠菜子藥材粉末約 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 80% 甲醇 25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率 250 W，頻率 40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用 80% 甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。除加樣品外以同法操作，制得空白溶液。結(jié)果如圖 3所示。

圖3 高效液相色譜圖

2.5.4 線性關(guān)系 從對(duì)照品儲(chǔ)備液中精密量取各溶液0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、2.0 mL和1.0 mL，分別置于 50 mL、50 mL、25 mL、25 mL和10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，依法測(cè)定，以溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y=14404×C-28065，r=0.9991。結(jié)果表明 β-蛻皮甾酮在 0.1290～1.2905 μg·mL-1(n=2) 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在制備 0、2、4、6、8、12、14、18、24 和 32 h后，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得 β-蛻皮甾酮含量的平均值為0.12%，RSD 為 0.78%。表明供試品溶液在室溫放置 32 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收 取已知含量的樣品 0.5 g共9份，精密稱定，分別加入不同量濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按供試品方法處理；在250 nm波長下進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)得平均加樣回收率為 100.16%，RSD為 1.87%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。結(jié)果見表 4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.7 重復(fù)性 取同一供試品共 6 份，精密稱定，按供試品的處理方法處理，并在 250 nm 波長下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得樣品平均質(zhì)量濃度為 0.120%，RSD 1.50%(n=6)。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好，測(cè)定方法可行。

2.5.8 樣品測(cè)定 取收集到的 25 批菠菜子藥材，精密稱定，按照“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品中β-蛻皮甾酮的 含量，結(jié)果見表5。

表5 菠菜子中β-蛻皮甾酮的含量 (n=2)

根據(jù)25批樣品的測(cè)試結(jié)果，暫定本品按干燥品計(jì)算，含 β-蛻皮甾酮(C27H44O7)，不得少于0.07%。

3 討論

3.1 TLC鑒別 筆者同時(shí)對(duì)該方法進(jìn)行系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn)，比較不同廠家(青島海洋化工有限公司、煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所及上海盛亞化工有限公)的 3 種硅膠 G 薄層板進(jìn)行比較，在不同濕度(25%、30%、40%)、不同溫度(18 ℃、25 ℃、30 ℃)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，供試品和對(duì)照品斑點(diǎn)均清晰，沒有本質(zhì)區(qū)別，說明該方法通用性較好。

3.2 浸出物考察 筆者采用不同濃度的(20%、40%、60%、80%、95%)乙醇溶液，分別用冷浸法和熱浸法對(duì)菠菜子的浸出物得率進(jìn)行考察，結(jié)果冷浸法得率較熱浸法高，且冷浸法中 20%～60% 乙醇提取時(shí)，浸出物得率差異不明顯。因此，選用稀乙醇為提取溶劑，采用冷浸法測(cè)菠菜子中浸出物。

3.3 供試品溶液的考察 分別對(duì)不同提取溶劑(70%、80%、90%、100%)甲醇和(70%、80%、90%、100% )乙醇、不同提取時(shí)間(20 min、3 min、40 min)、不同提取方式(超聲提取、回流提取)、不同物料比(1∶25、1∶30、1∶40)進(jìn)行考察，結(jié)果表明：在80% 甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，物料比為1∶25時(shí)，供試品中 β-蛻皮甾酮的含量最高。

3.4 HPLC測(cè)定結(jié)果 菠菜子中 β-蛻皮甾酮含量范圍在 0.073%～0.205%，其中產(chǎn)地為山東臨沂、甘肅隴西、安徽亳州、河北安國及河南南陽的5批菠菜子中β-蛻皮甾酮含量顯著高于產(chǎn)地為新疆和田的菠菜子。說明菠菜子中 β-蛻皮甾酮的含量高低可能與菠菜子的種植地有關(guān)，受種植環(huán)境的影響，β-蛻皮甾酮的含量會(huì)有所差異；也可能是由于這5批菠菜子采收時(shí)間較近，存放時(shí)間較短，造成含量有所差異。這為菠菜子的種植環(huán)境和存儲(chǔ)的要求提供了參考，具體含量差異原因，后期會(huì)進(jìn)一步深入研究。

4 小結(jié)

目前，國內(nèi)對(duì)菠菜的研究?jī)H限于種植方法、原植物組織形態(tài)和藥理作用等方面，對(duì)菠菜及其果實(shí)中化學(xué)成分及其含量分析尚未見報(bào)道。筆者參照《中國藥典》2015年版一部牛膝藥材項(xiàng)的TLC鑒別和含量測(cè)定方法，建立菠菜子中β-蛻皮甾酮的TLC 鑒別和含量測(cè)定的方法，該方法簡(jiǎn)便、可靠、重現(xiàn)性好，并根據(jù)25批樣品的測(cè)定結(jié)果，暫定本品按干燥品計(jì)，含β-蛻皮甾酮，不得少于0.07%，用于控制菠菜子藥材的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)研究旨在為菠菜子安全用藥和化學(xué)成分研究提供理論依據(jù)，為菠菜子藥材標(biāo)準(zhǔn)提高奠定基礎(chǔ)，也為更好的控制維藥的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。