羅建蓉 唐 策 李軒豪 張 藝

1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 67100；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

琵琶甲是云南民間常用的一種藥用昆蟲，為鞘翅目擬步甲科昆蟲喙尾琵琶甲(BlapsrynchopeteraFairmaire)的成蟲，收載于《中國民族藥辭典》，具有清火解毒、軟堅散結(jié)、消腫止痛、熄風(fēng)定驚之功效[1]。云南民間常用于治療發(fā)燒、咳嗽、胃炎、疔瘡、腫瘤等疑難雜癥[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)琵琶甲具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗菌等藥理作用[3]；琵琶甲含有酚類[4-5]、多巴胺衍生物[6]、生物堿[7]、環(huán)肽[8]、油脂等成分類型。本課題組前期從琵琶甲中分離得到多個酚類成分，并包括5個新酚類成分[5]。已報道的琵琶甲化學(xué)成分中，酚類數(shù)量最多，是琵琶甲的重要化學(xué)成分組成。從琵琶甲中發(fā)現(xiàn)的原兒茶酸、羥基酪醇和原兒茶醛，這些酚類也廣泛分布在果蔬、植物藥中，對其藥理作用研究較廣且深入，而對其他酚類，尤其從該昆蟲中發(fā)現(xiàn)的新酚類成分的藥理研究較為缺乏且不深入，大多局限在抗氧化、抗癌等體外活性初篩階段，其藥理作用機制尚不明確，限制了琵琶甲藥用價值的開發(fā)利用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究中藥“多成分-多靶點-多途徑”復(fù)雜體系治療復(fù)雜疾病提供很好的研究策略和方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在烏頭湯、六味地黃丸、清絡(luò)飲等中藥方劑的藥效物質(zhì)與作用機理的研究中得到有效運用[9-10]。文章基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以琵琶甲中酚類成分為研究對象，采用反向藥效團匹配方法篩選潛在靶點蛋白和作用通路，通過構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，探討琵琶甲可能發(fā)揮藥效的活性成分，預(yù)測其對多種疾病可能存在的藥理作用及作用機制，為琵琶甲酚類成分的研究提供參考和借鑒，并為昆蟲琵琶甲藥用價值的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分收集與類藥性分析 結(jié)合課題組前期研究及檢索CNKI、SciFinder、PubMed等數(shù)據(jù)庫，提取琵琶甲的酚類成分，依據(jù)Lipinski 規(guī)則篩選其類藥性。Lipinski 規(guī)則是藥物分子設(shè)計和篩選中最常用的規(guī)則之一，如果化合物具有良好的吸收和滲透特性，應(yīng)滿足以下條件[11]：①氫鍵供體數(shù)目不大于5；②氫鍵受體數(shù)目不大于10；③脂水分配系數(shù)Clog P 不大于5；④相對分子質(zhì)量不大于500。

1.2 琵琶甲酚類成分潛在靶點預(yù)測 運用反向分子對接服務(wù)器PharmMapper server，預(yù)測化合物或天然活性成分的潛在作用靶點[12]。將酚類結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PharmMapper服務(wù)器，獲取靶蛋白的PDB ID，靶點名稱(target name)和匹配值(Fit Score)。匹配值越高代表分子與靶點越匹配，故取匹配值前10位的蛋白作為該化合物的重要靶點蛋白。命名不規(guī)范的靶點需進一步通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲得規(guī)范的蛋白編號，并獲得相應(yīng)的基因信息。

1.3 靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將獲得的琵琶甲潛在作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為Homo sapiens，獲得靶點的相互作用關(guān)系，通過Cytoscape 軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并進行網(wǎng)絡(luò)的拓撲特征分析，篩選網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，并將節(jié)點大小和顏色設(shè)置為反應(yīng)degree的大小，線條的粗細表示Combined score值的大小。

1.4 通路富集分析 將靶點信息導(dǎo)入生物分子功能注釋系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫MAS 3.0，得到靶點的相關(guān)通路信息，并應(yīng)用KEGG通路數(shù)據(jù)庫進行通路注釋分析和富集分析[13]。

1.5 琵琶甲主要酚類成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以篩選的25個酚類成分、潛在靶點和通路為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(node)，導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建琵琶甲酚類成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 琵琶甲中酚類成分的收集與類藥性分析結(jié)果 共收集到25個類藥性符合Lipinski規(guī)則的活性酚類成分，化合物相關(guān)信息見表1。它們大多具有鄰二酚羥基的結(jié)構(gòu)特點，其中化合物1～7、10～13是從昆蟲琵琶甲中發(fā)現(xiàn)的新化合物；原兒茶酸、羥基酪醇和原兒茶醛則在天然產(chǎn)物中廣泛分布，且藥理活性多樣。

表1 琵琶甲中25個酚類化學(xué)成分基本信息

續(xù)表1

2.2 琵琶甲中酚類成分潛在靶點預(yù)測 經(jīng)反向藥效團匹配實驗預(yù)測得25個酚類成分的潛在作用靶點，各取匹配值前10的靶點，去掉重復(fù)靶點共得121個不同靶點。結(jié)果顯示琵琶甲中不同酚類成分既可作用于相同靶點，也可作用于不同靶點，其中CRABP2、GCK、FKBP1A、PCK1、NR3C1、MME、SULT2B1、FGG、MTAP、GSTT2B、SRC、HRAS、IL2、PNMT、IMPA1等靶點出現(xiàn)的頻率較高，是主要的潛在靶點蛋白群，它們在細胞生長、死亡、細胞周期等細胞過程中發(fā)揮重要作用。

圖1 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 琵琶甲中酚類成分靶點蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 剔除獨立于網(wǎng)絡(luò)之外的靶標蛋白，得酚類成分的靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，包含121個節(jié)點、437 條邊，平均度值為7.2，靶點的degree值越大，節(jié)點越大，顏色越深，表示靶點重要性越大。SRC、HRAS、IL2、GART、AR、F2、KDR、RXRA、JAK2等靶點的度值較高，為連通網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點的橋梁，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，靶點間相互作用、協(xié)同起效。

2.4 琵琶甲中酚類成分潛在靶點的通路注釋分析 121個潛在靶點投入MAS 3.0生物分子功能注釋系統(tǒng)，獲得72條P小于0.05的重要通路，并經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析，主要涉及疾病、免疫與炎癥、內(nèi)分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等相關(guān)信號通路，表2列舉出顯著性和頻率較高的42條相關(guān)通路信息。與人類疾病直接相關(guān)通路有12條，為前列腺癌、小細胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細胞肺癌、急性髓系白血病、甲狀腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、原發(fā)性免疫缺陷、阿爾茨海默病和二型糖尿病，可見涉及腫瘤類疾病相關(guān)信號通路最多。涉及免疫與炎癥相關(guān)的重要通路主要有黏著斑、血管內(nèi)皮生長因子、黏著連接、過氧化物酶體增殖劑激活受體、T細胞受體信號通路、花生四烯酸代謝、細胞絲裂原活化蛋白激酶、FcεRI、Jak-STAT信號通路等。與內(nèi)分泌相關(guān)的主要通路有胰島素信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、PPAR、脂肪細胞因子信號通路、促性腺激素釋放激素信號通路等。與代謝相關(guān)通路中，嘌呤代謝、細胞色素P450介導(dǎo)的外源性物質(zhì)代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解和糖異生、嘧啶代謝和谷胱甘肽代謝顯著性和頻數(shù)居前列。與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)主要通路為VEGF、表皮生長因子受體、緊密連接、Jak-STAT等。

表2 琵琶甲主要酚類成分潛在作用通路

續(xù)表2

2.5 GO富集分析 琵琶甲中酚類成分潛在的121個靶點經(jīng) MAS 3.0系統(tǒng)進行GO富集分析，獲取生物學(xué)過程、細胞組成和分子功能的富集條目，預(yù)測靶點的功能分布。GO富集結(jié)果顯示，以P<0.05為標準，靶點基因主要富集于364個生物學(xué)過程、243 種分子功能和68類細胞組成。其中，在生物學(xué)過程中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)水解、碳水化合物代謝、氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA依賴性所占比例較大；細胞質(zhì)、細胞核、胞質(zhì)溶膠、質(zhì)膜、膜、胞外區(qū)和線粒體在細胞組成中較重要；在分子功能中，轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白結(jié)合、核苷酸結(jié)合、離子結(jié)合、ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合、水解酶活性和肽酶活性作用較突出。圖2分別列出了顯著性較高和比例較大的26種生物過程、20種細胞組成和23種分子功能。

圖2 琵琶甲酚類成分潛在靶點的GO富集分析

圖3 化合物-靶點-作用通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 琵琶甲酚類成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 25個酚類成分、121個靶點及72條信號通路共同組成網(wǎng)絡(luò)圖中的218個節(jié)點，成分、靶點、通路之間的相互作用組成了487條邊，具體網(wǎng)絡(luò)關(guān)系如圖3所示。分析結(jié)果表明，靶點GTP結(jié)合Harvey 大鼠肉瘤病毒癌基、糖原合成酶激酶3β、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、葡萄糖激酶、細胞視黃酸結(jié)合蛋白、非受體型酪氨酸激酶、乙醇脫氫酶族3、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1、及腦啡肽酶的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點聯(lián)接度排名前10位，為網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點，表明它們可能是琵琶甲酚類成分的核心作用靶點。由圖3可見，琵琶甲中酚類成分、靶點、通路間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，相同成分對應(yīng)多個靶點，同一靶點連接多種成分，多條通路之間通過共有靶點連接存在協(xié)同作用，而非孤立的，體現(xiàn)出多成分、多靶點、多途徑的網(wǎng)絡(luò)特征。

3 討論

藥用昆蟲琵琶甲富含蛋白、多肽、油脂、多糖等大分子及氨基酸、核苷等營養(yǎng)成分，而其豐富的小分子次生代謝產(chǎn)物所發(fā)揮的藥效不容忽視。盡管該昆蟲的藥用價值獲得持續(xù)關(guān)注，但仍缺乏研究從整體上來闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效及其作用機制。目前對琵琶甲的藥理實驗研究主要集中在對其總提物的抗腫瘤和抗炎活性方面[3]，且未深入研究相關(guān)作用機制。故本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和系統(tǒng)生物整體的角度探討琵琶甲主要酚類活性成分的藥理作用機制，并闡釋琵琶甲消炎、消包塊的傳統(tǒng)功效，預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)琵琶甲除對腫瘤、炎癥外，還對糖尿病、阿爾茨海默病等內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)方面疾病有治療作用，并預(yù)測得到相關(guān)重要靶點及通路，可為昆蟲琵琶甲藥用價值的深入研究和開發(fā)提供參考。

預(yù)測發(fā)現(xiàn)琵琶甲酚類成分的121個主要作用靶點通過干預(yù)胰島素信號通路、嘌呤代謝、黏著斑、VEGF信號通路、PPAR信號通路等72條主要的相關(guān)疾病代謝通路發(fā)揮多種療效，反映琵琶甲酚類成分與靶點和通路間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。分析網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)有8條通路與人類疾病癌癥直接相關(guān)，分別為前列腺癌、小細胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細胞肺癌、急性髓系白血病、甲狀腺癌、膀胱癌和黑色素瘤，由此可見抗癌作用可能是琵琶甲主要酚類成分的最主要藥效作用之一。同時網(wǎng)絡(luò)還顯示在癌癥信號通路中靶點HRAS、PDPK1、RXRA、FGFR1、GSK3B、RARB、AR、GSTP1、NOS2、APAF1、PTK2、CTNNA1、PIM1、MMP、RARA、DAPK1等發(fā)揮重要作用，這對探討琵琶甲酚類成分的抗癌作用靶點及機制具有重要指導(dǎo)意義。本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果琵琶甲中酚類成分的抗癌作用得到了實驗研究證實，blapsins A、blapsins B、rynchopeterines B、rynchopeterines C、原兒茶酸、羥基酪醇、原兒茶醛等成分具有抗腫瘤活性。研究表明blapsins A和blapsins B具有抑制癌癥HIS14-3-3蛋白活性[14]，rynchopeterines B和rynchopeterines C能抑制癌細胞Caco-2 和A549 的生長[5]。原兒茶酸能通過抑制成纖維細胞生長因子、MMP2和MMP9蛋白表達，從而抑制A549、H3255和Calu-6三種非小細胞肺癌細胞生長[15]。原兒茶酸通過抑制Ras / Akt / NF-κB通路，進而抑制黑色素瘤細胞在小鼠肝臟的轉(zhuǎn)移[16]。羥基酪醇通過抑制Akt / STAT3和NF-κB通路，抑制雄激素受體的應(yīng)答，從而抑制前列腺癌細胞增殖[17]。高劑量羥基酪醇可誘導(dǎo)乳頭狀甲狀腺癌細胞系和濾泡甲狀腺癌細胞凋亡[18]。原兒茶醛能抑制人結(jié)直腸癌HCT116細胞生長和誘導(dǎo)細胞凋亡[19]。

此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測得琵琶甲酚類成分作用于Focal adhesion、VEGF、PPAR、Adherens junction、MAPK、Jak-STAT、ErbB、Fc epsilon RI、mTOR、T cell receptor、B cell receptor、Arachidonic acid metabolism等多條炎癥相關(guān)的重要通路，推測抗炎可能是琵琶甲酚類的重要藥效作用。實驗研究表明，rynchopeterines B 能通過降低TNF-α、IL-1β、PGE2、COX-2和TGF-β1炎癥因子表達，發(fā)揮出顯著的抗大鼠慢性前列腺炎作用[20]。Blapsols A～D能夠抑制COX-2活性[6]。原兒茶酸可抑制LPS刺激角質(zhì)細胞的炎性介質(zhì)產(chǎn)生[21]；還能對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護作用[22]。原兒茶酸明顯抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細胞(MCs)增殖，保護MCs免受高糖損傷[23]。但目前對琵琶甲酚類成分抗炎作用的研究報道還較少，有必要加強相應(yīng)的實驗驗證工作。

研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)琵琶甲中酚類成分主要通過胰島素、二型糖尿病、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、PPAR、mTOR、脂肪細胞因子、GnRH、黑素生成等信號通路，對內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，羥基酪醇對氧化損傷相關(guān)疾病具有良好的防治效果，它能緩解血管內(nèi)皮功能障礙，減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展[24]。羥基酪醇能改善胰島素信號通路，并通過抑制mTOR改善胰島素抵抗；能降低糖尿病模型大鼠的空腹血糖，提高肝糖原含量；還能提高MetS模型大鼠的糖耐量及胰島素敏感性[25]。原兒茶醛在抗動脈粥樣硬化、保護心肌、抗血栓形成，神經(jīng)保護，抗纖維化等方面具有較好的藥理活性[26]。

研究結(jié)果還顯示，琵琶甲中酚類成分在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面主要涉及GSK3B、NOS2、 HRAS、BACE1、PPP1CC等重要靶點，和阿爾茨海默病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、神經(jīng)營養(yǎng)因子、FcεRI、ErbB、MAPK等通路發(fā)揮作用。其中，GSK-3β參與阿爾茨海默病、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、細胞周期、磷酸化途徑、胰島素、癌癥、ErbB等信號通路，GSK-3β是tau激酶，在AD病程發(fā)展中的記憶障礙、小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥、tau蛋白磷酸化、炎性因子的釋放以及突觸丟失和神經(jīng)元死亡等方面，從多途徑發(fā)揮抗AD的作用[27]。研究發(fā)現(xiàn)，羥基酪醇能夠保護神經(jīng)元抵御Aβ造成的損傷，顯著降低神經(jīng)元內(nèi)氧化應(yīng)激水平；能有效抑制多巴胺氧化誘導(dǎo)的細胞凋亡，可以輔助單胺氧化酶抑制劑用于帕金森病的治療[24]；原兒茶酸有良好的神經(jīng)保護作用，可改善Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細胞毒性，對阿爾茨海默病(AD)細胞模型有保護作用，對AD具有潛在的治療作用[28]；還能明顯降低帕金森模型大鼠血清TNF-α、MDA及IL-1β水平，提高SOD活性，對帕金森病引起的氧化應(yīng)激損傷有保護作用[29]。其他酚類成分的相關(guān)藥理作用，仍需進一步細胞及動物實驗驗證。

昆蟲琵琶甲中的酚類成分繁多，目前對其藥理作用的研究主要集中在原兒茶酸、羥基酪醇和原兒茶醛上，而對從該昆蟲中發(fā)現(xiàn)的11個新酚類成分rynchopeterines A～E、Blapsols A～D、blapsins A和blapsins B的研究甚少，局限在DPPH自由基清除作用，腫瘤細胞毒作用，對COX抑制活性等方面的體外活性測試上，它們的藥理作用及機制仍有待深入探討。本研究預(yù)測得這些酚類的相關(guān)藥理作用、靶點蛋白與作用通路將為進一步深入藥理作用機制的實驗研究提供參考。