王 燕，謝親建，馬弢業(yè)，丁曉煜，王愛(ài)昕，潘 銘

1 武威市人民醫(yī)院,甘肅 武威 733000；2 武警甘肅省總隊(duì)醫(yī)院；3 蘭州大學(xué)藥學(xué)院；4 西北民族大學(xué)第二附屬醫(yī)院

白血病是一種骨髓干細(xì)胞無(wú)限增殖的克隆性疾病，俗稱為血癌。主要癥狀為流鼻血、面部蒼白、食欲減退等。隨著經(jīng)濟(jì)條件的發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)的改變，學(xué)者對(duì)白血病的研究越來(lái)越多。白血病大致分為慢性和急性兩種［1-2］，急性白血病多發(fā)生于兒童，而且發(fā)病率逐年上漲，根據(jù)國(guó)際治療白血病的規(guī)劃方案，治療白血病的藥物極少，且此病容易耐藥，治愈率較低。以前人們無(wú)論用化學(xué)合成、物理提取的藥物，還是從生物學(xué)的角度改變基因蛋白等，都無(wú)法從根本上治療白血病。白刺果（Nitraria L.）常被用來(lái)治療胃部不適等癥狀。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白刺果對(duì)胃癌具有治療作用。基于此，我們從分子生物學(xué)的角度研究白刺果對(duì)白血病細(xì)胞NB4 的影響，了解其對(duì)白血病細(xì)胞的抑制作用，為臨床診斷提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試藥與試劑白刺果采摘于騰格里沙漠，經(jīng)蘭州大學(xué)生藥學(xué)研究所馬志剛教授鑒定為蒺藜科白刺屬的灌木果實(shí)；小牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)：22011-8612）；RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone，SH30809.01）；NB4 細(xì)胞株（蘭州大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)）；陽(yáng)性對(duì)照藥物亞砷酸鈉注射液（哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990191）。

1.2 儀器Sartorius 分析天平（SARTORIUSBT23S）；Thermo CO2培養(yǎng)箱（thermo-scientific公司）；Multiskan Spectrum 酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Scientific公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白刺果的制備 取白刺果500 g，清水沖洗、曬干；放入燒瓶，加入純水500 mL，煎煮3次，每次1 h，蒸餾，合并濾液，比重為1.025～1.030 g/mL，待用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與MTT 檢測(cè) 將凍存的白血病細(xì)胞株NB4 在37℃水浴中迅速融化，加入3 mL 培養(yǎng)液吹打后放入10 mL離心管中，離心半徑：10 cm，1000 r/min，離心5 min，棄去上清液，用含有10%胎牛血清、雙抗（100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素）的培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌環(huán)境中操作。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞株NB4，用含10%小牛血清的RPM1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至2.0×105/mL，接種至96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。等待2 h 后，分別加入不同濃度（5、10、20、40 μg/mL）的白刺果浸取液100 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)孔，并設(shè)對(duì)照組。分別于培養(yǎng)12、24、36 h 后每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 試劑 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加三聯(lián)液，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以570 nm測(cè)量波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度（A），按以下公式計(jì)算：

抑制率（%）=（對(duì)照組-給藥組）／對(duì)照組

1.3.3 PI 檢測(cè)細(xì)胞周期 將白血病細(xì)胞株NB4調(diào)整至 2.0×105個(gè)/mL，接種于 6 孔板，每孔 3 mL。4 h后加入不同濃度的白刺果浸取液，每孔加入藥物后終體積為1000 μL。培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，離心半徑：10 cm，1000 r/min，離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS 重懸細(xì)胞，離心洗滌3 次，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇5℃固定過(guò)夜。上機(jī)前用PBS 溶液洗滌，加入PI 染色液（含RNA 酶5 mg/mL），終濃度為500 μg/mL，避光染色15～20 min，300 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量的變化。

1.3.4 免疫印跡法檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期白血病NB4細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)/mL，接種于 6 孔板，每孔 4 mL，30 min 后加入白刺果進(jìn)行干預(yù)，作用24 h后收集細(xì)胞，每組細(xì)胞裂解液，于冰上裂解 25～30 min，12 000 r/min 離心后棄沉淀，收集上清，保存于-20℃?zhèn)溆谩：罄m(xù)將分離的蛋白經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育，抗體的稀釋比例分別為細(xì)胞色素c（Cytochrome C，Cmy-c）（1∶500），B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（1∶500），Caspase-3 家族（Pro-caspase3）（1∶500），β-actin（1∶500），一抗在 4℃的冰箱中孵育過(guò)夜，洗滌2 次，孵育二抗，再洗滌2 次，采用ECL發(fā)光液，采用膠片曝光形式。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Excell 2007 錄入數(shù)據(jù)，采用一般描述性分析。

2 結(jié)果

2.1 白血病NB4 細(xì)胞周期白刺果對(duì)白血病的抑制周期發(fā)生在G1期，這與三氧化二砷抑制白血病細(xì)胞的周期相一致。白刺果、三氧化二砷作用于白血病細(xì)胞凋亡顯示，當(dāng)白刺果和三氧化二砷的濃度為5 μg/mL時(shí)，抑制率分別為5.66%和47.6%；當(dāng)白刺果和三氧化二砷的濃度為10 μg/mL 時(shí)，抑制率分別為25.68%和32.26%，相同濃度的白刺果對(duì)白血病細(xì)胞的抑制率低于三氧化二砷。見(jiàn)圖1。

2.2 白血病NB4 細(xì)胞抑制率白刺果對(duì)白血病NB4 細(xì)胞具有抑制作用，隨著時(shí)間的延續(xù)或濃度的遞增，對(duì)白血病細(xì)胞的抑制率增高，當(dāng)濃度為20 μg/mL時(shí)，抑制細(xì)胞的程度趨于平衡，這可能是細(xì)胞的增殖太快，藥物濃度降低的緣故，另外，相同濃度的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)，藥物作用的整個(gè)過(guò)程中，時(shí)間越長(zhǎng)，抑制白血病細(xì)胞的效果越好，且抑制程度與濃度和時(shí)間具有正相關(guān)性。見(jiàn)圖2。

2.3 白血病NB4 細(xì)胞凋亡蛋白的分析白刺果可以激活線粒體途徑，對(duì)Cmy-c 或Bcl-2 起作用，隨著濃度的升高，蛋白的表達(dá)下降見(jiàn)圖3。

圖1 對(duì)白血病細(xì)胞NB4細(xì)胞周期的影響

圖2 不同濃度白刺果對(duì)白血病細(xì)胞NB4的抑制率

3 討論

每年大約有18.5%的人死于白血病，近年來(lái)白血病的患病人群逐漸年輕化［3-6］。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)和前期的研究可知，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制先是通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控［7-8］，細(xì)胞周期是任何一種細(xì)胞生命的特征，細(xì)胞周期也是發(fā)生惡性血液循環(huán)的主要原因之一；其次，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制是通過(guò)Caspase家族和Bcl-2家族系統(tǒng)，通過(guò)激活Pro-Caspase 途徑，再進(jìn)一步激活線粒體途徑，從而阻斷細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，達(dá)到抑制的效果，也就是促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。白刺果抑制白血病NB4 細(xì)胞正是通過(guò)線粒體途徑降低Cmy-C 和Bcl-2 蛋白的含量。另外，從白刺果的成分可知，白刺果中含有大量的黃酮化合物，黃酮化合物能夠抑制調(diào)控細(xì)胞周期［9］，凋亡誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，抑制細(xì)胞增殖，對(duì)于血液系統(tǒng)疾病來(lái)說(shuō)，可調(diào)節(jié)血液細(xì)胞，影響血管生成［10-12］?；诖?，白刺果對(duì)白血病的治療作用，可能是黃酮類化合物在起重要作用，至于哪種黃酮類化合物起作用，有待于進(jìn)一步研究。

圖3 對(duì)白血病細(xì)胞NB4凋亡蛋白的影響