王 龍，馬 磊，黃 燕，張 勇，席紅娜，呂建瑞

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MI/RI）多見于冠心病、心肌梗死以及冠狀動脈介入治療的患者，是指心肌在受到較長時間缺血后，當血液再恢復(fù)灌注時給心肌帶來的病理性組織損害，這種損害包括直接的病理性組織損傷、心臟功能下降及心臟代謝障礙等，嚴重者可致患者死亡［1-2］。目前 MI/RI 的發(fā)生機制還沒有完全明確，治療原則主要以預(yù)防為主［3］。中醫(yī)藥在預(yù)防本病中有獨特優(yōu)勢，包括一些中藥湯劑和中藥提取物在本病的預(yù)防治療方面有許多文獻報道［4-5］。楊梅素即是其中之一，國內(nèi)學(xué)者邵玲等［6］研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素對MI/RI大鼠具有明顯的保護作用，其機理與楊梅素可調(diào)節(jié)PI3K、AKT 和 mTOR 蛋白表達有關(guān)。此外還有研究［7］觀察了楊梅素對離體MI/RI 大鼠模型的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)楊梅素對其也有很好的調(diào)節(jié)作用，其作用機理是通過調(diào)節(jié)PPARγ/NF-κB 信號通路實現(xiàn)的，但是目前的研究還沒有心肌血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的研究報道，因此本研究采用楊梅素干預(yù)大鼠，觀察大鼠發(fā)生MI/RI 后HO-1 蛋白及mRNA 的表達特點，以豐富楊梅素預(yù)防治療MI/RI的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇72 只健康雄性SD 大鼠，清潔級，體質(zhì)量180～220 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，實驗動物合格證號：SCXK 2015-001。飼養(yǎng)條件：大鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房，由專業(yè)人員按照國際標準［8］飼養(yǎng)，在購買后先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑楊梅素（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號：529-44-2）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號分別為：CSB-E08556m、CSB-E05840h、CSB-E04639m和CSB-E09315h）；總蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：BC3790）；總RNA 提取試劑盒（北京天根生物試劑有限公司，批號：DP419），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega 公司，批號：A3500）；兔抗大鼠血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和甘油三磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國 Santa Cruz 公司，批號分別為：sc-1796 和 sc-59540）；辣根酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記的羊抗兔二抗（北京中杉生物技術(shù)有限公司，批號：ZB-2306）；引物（武漢谷歌生物設(shè)計并生產(chǎn)）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及給藥 按照隨機數(shù)字表法將72 只健康雄性SD大鼠分為假手術(shù)組（生理鹽水1.0 mL/kg灌胃），模型組（生理鹽水1.0 mL/kg灌胃），陽性對照組（阿司匹林10 mg/kg灌胃），楊梅素高（楊梅素400 mg/kg 灌胃）、中（楊梅素 200 mg/kg 灌胃）、低（楊梅素100 mg/kg 灌胃）劑量組，每組12 只。給藥劑量根據(jù)文獻報道［9］確定，給藥2周后進行后續(xù)實驗。

1.3.2 模型制備 大鼠MI/RI模型根據(jù)文獻［10］報道的方法進行制備，大鼠禁食不禁水12 h后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，后將其固定，行氣管插管，同時用心電圖記錄儀記錄大鼠心電圖，找到第四根肋骨后剪斷，剪開心包，暴露心臟，剝離心包膜后于左心耳下緣2～3 mm處結(jié)扎，后進行常規(guī)缺血再灌注損傷手術(shù)，而假手術(shù)組只給予穿線但不結(jié)扎。造模成功的標志為，大鼠心臟下部心肌組織顏色發(fā)白，同時心電圖有明顯ST 段抬高（缺血30 min，再灌注120 min）。

1.4 觀察指標

1.4.1 組織學(xué)觀察 1）實驗完成后，采用腹主動脈取血法采集大鼠血液，血液收集后使用低溫高速離心機離心（4℃，離心半徑4 cm，4000 r/min，離心10 min），離心后收集血漿，將其置入超低溫冰箱中用于相關(guān)生化指標的檢測。血液收集后采集心臟組織，將其分成三部分：其中一部分置入組織固定液中用于相關(guān)病理學(xué)檢測，一部分置入超低溫冰箱中用于蛋白和mRNA 的檢測，剩余一部分置入-20℃冰箱中用于心臟相關(guān)生化指標的檢測。2）從組織固定液中取出心臟組織，根據(jù)文獻［11］報道方法，采用HE 染色檢測心肌組織病理學(xué)，檢測完成后采用光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理學(xué)變化特點，每張切片均選取4個不同視野。

1.4.2 實驗室指標 1）采用全自動生化分析儀檢測各組血液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）含量。2）采用酶標儀測定各組大鼠心臟中SOD、MDA、IL-6 和 TNF-α 含量。3）采用 Western blot測定心肌組織HO-1 蛋白表達，從超低溫冰箱中取出心臟組織，按照總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白后并測定蛋白含量，后將其統(tǒng)一調(diào)平，完成后每組各取50 μg 行SDS-PAGE 電泳分離，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h 后洗滌 3 次，后加入一抗封閉（HO-1 抗體（1∶1500），GAPDH 抗體（1∶3000））過夜，次日取出后采用TBST洗滌 3 次，加入 2 抗（1∶3000）40 min 后，洗滌 3 次，采用增強型DAB 顯色試劑盒對其進行顯影，后掃描膜，采用圖像分析軟件分析每個蛋白積分光密度值（IOD），結(jié)果以 HO-1 的 IOD 值與 GAPDH 條帶的IOD 值的比值作為HO-1 的相對表達量。4）采用RT-PCR 技術(shù)檢測心肌組織HO-1 mRNA 表達，從超低溫冰箱中取出心臟組織，按照試劑盒提供的說明書用總RNA 提取試劑盒提取各組大鼠心肌組織總RNA，完成后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的說明書將其逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，后每組各取 2 μg 行 PCR 擴增反應(yīng)，擴增反應(yīng)條件為：95℃ 2 min、94℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 40 s，循環(huán)次數(shù)34 次。引物序列：HO-1，上游序列：5'-AGCCCCACCAAGTTCAAACA-3'，下游序列：5'-TGCCAACA GGAAGCTGAGAG-3'，擴增片斷 321 bp。GAPDH，上游序列：5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'，下游序列：5'-CCACAGGATTCCATACCCAA-3'，擴增片段446 bp，分析方法為2-ΔΔCt法。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LDH和CK活性與假手術(shù)組比較，模型組血清LDH和CK水平均明顯升高（P＜0.05）；相較于模型組，陽性對照組和楊梅素各劑量組LDH、CK 水平均明顯降低（P＜0.05），其中以楊梅素高劑量組明顯低于陽性對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌酶LDH和CK水平比較（） U/L

表1 各組大鼠心肌酶LDH和CK水平比較（） U/L

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與陽性對照組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組楊梅素低劑量組楊梅素中劑量組楊梅素高劑量組CK 640.18±80.21 1613.51±178.16*1264.72±160.40*#1328.14±110.27*#1179.35±123.47*#983.24±98.15*#△鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 LDH 1138.36±98.27 4950.26±442.18*3183.21±408.29*#3279.16±275.31*#3085.26±298.15*#2641.19±273.28*#△

2.2 心肌組織中SOD、MDA、IL-6和TNF-α水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中MDA、IL-6和TNF-α水平顯著提高，SOD水平下降（P＜0.05），與模型組比較，楊梅素各劑量組和陽性對照組MDA、IL-6 和 TNF-α 水平明顯降低（P＜0.05），SOD 水平明顯升高（P＜0.05），此外楊梅素高劑量組MDA、IL-6和TNF-α水平明顯低于陽性對照組（P＜0.05），SOD水平明顯高于陽性對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織中SOD、MDA、IL-6和TNF-α水平比較（）

表2 各組大鼠心肌組織中SOD、MDA、IL-6和TNF-α水平比較（）

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與陽性對照組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組組楊梅素低劑量組楊梅素中劑量組楊梅素高劑量組TNF-α（pg/mg）20.15±6.43 56.68±14.65*39.71±11.18*#40.25±13.26*#37.68±12.17*#34.26±9.35*#△鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 SOD（U/mg）88.47±10.18 21.35±14.18*64.39±17.21*#64.57±14.36*#68.24±13.18*#74.82±13.28*#△MDA（nmol/mg）0.46±0.15 3.92±0.56*1.27±0.34*#1.39±0.31*#118±0.27*#0.98±0.28*#△IL-6（pg/mg）24.80±6.21 73.46±18.33*46.18±10.28*#45.36±12.47*#42.84±9.35*#39.71±10.58*#△

2.3 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察大鼠心肌組織病理學(xué)可見，假手術(shù)組心肌纖維形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰；模型組出現(xiàn)明顯病理變化，主要表現(xiàn)為心肌纖維斷裂，結(jié)構(gòu)稀疏；與模型組相比，楊梅素低劑量、中劑量和高劑量組逐漸好轉(zhuǎn)，特別是楊梅素高劑量組僅有少量的細胞結(jié)構(gòu)變性。此外楊梅素高劑量組心肌組織形態(tài)也明顯好于陽性對照組。見圖1。

圖1 心肌組織染色結(jié)果（HE×400）

2.4 心肌組織HO-1 mRNA和蛋白表達各組大鼠心肌組織中HO-1蛋白及mRNA表達，與假手術(shù)組比較，HO-1 蛋白模型組有一定升高（P＜0.05），與模型組比較，楊梅素各劑量組和陽性對照組進一步升高（P＜0.05），但楊梅素各劑量組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2，表3。

圖2 心肌組織中HO-1蛋白表達

表3 各組大鼠心肌HO-1蛋白及mRNA相對表達量（） mmol/L

表3 各組大鼠心肌HO-1蛋白及mRNA相對表達量（） mmol/L

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

HO-1 mRNA表達1.01±0.01 1.26±0.16*2.08±0.24*#1.96±0.19*#2.03±0.22*#2.19±0.18*#組別/指標假手術(shù)組模型組陽性對照組楊梅素低劑量組楊梅素中劑量組楊梅素高劑量組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 HO-1蛋白表達0.67±0.11 0.74±0.12*1.47±0.18*#1.45±0.12*#1.43±0.14*#1.50±0.11*#

3 討論

MI/RI 危害極大，近年來大量流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者在發(fā)生MI/RI后，約有10%的患者發(fā)生死亡，心功能不全的患者MI/RI 發(fā)生后死亡率高達25%，即使是已經(jīng)進行手術(shù)的心肌梗死患者，也有2%～3%的患者死于MI/RI，25%的患者雖然不會死亡，但再灌注后會引起不同程度的心率失常、低血壓甚至心功能不全等并發(fā)癥，給患者帶來極大的損害［10-14］。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，溶栓治療和冠狀動脈介入手術(shù)廣泛推廣，上述治療雖然可以極大減少心肌缺血時間，但對心肌的損傷依然存在，因此開發(fā)藥物盡可能減少MI/RI是當前研究的熱點［15］。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種黃酮類化合物對治療MI/RI 有獨特優(yōu)勢。劉丹等［16］構(gòu)建了MI/RI動物模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以通過調(diào)節(jié)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regu-lated protein78，GRP78）表達，進而保護心肌組織。此外，梁麗梅等［17］研究發(fā)現(xiàn)龍血竭總黃酮可通過調(diào)節(jié)抗氧化能力保護MI/RI 大鼠心肌損傷。楊梅素也是黃酮類化合物之一，其對心肌的保護作用已有文獻報道，本次研究進一步明確楊梅素保護MI/RI機理。研究中首先構(gòu)建了MI/RI大鼠模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組心肌細胞明顯斷裂，心肌有一定的炎癥反應(yīng)發(fā)生，同時心肌酶LDH 和CK 明顯升高，這提示本次研究模型成功構(gòu)建，而使用楊梅素治療后，LDH 和CK 明顯降低，心肌組織病理學(xué)也明顯好轉(zhuǎn)，這證實了楊梅素確實可以很好地預(yù)防MI/RI大鼠心肌損害。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，HO-1 蛋白具有明顯提高抗氧化能力的作用，HO-1 是體內(nèi)的一種常見的抗氧化調(diào)節(jié)蛋白，其調(diào)節(jié)作用可能是因為HO-1 可以氧化分解體內(nèi)的血紅素，而血紅素可分解形成膽紅素，膽紅素則具有明顯的抗氧化作用［18］。關(guān)于其抗氧化作用的研究，如國外學(xué)者Turkseven 等［19］構(gòu)建了糖尿病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)通過直接誘導(dǎo)HO-1表達可以提高體內(nèi)多種抗氧化指標，包括SOD、內(nèi)皮型一氧化氮及過氧化氫酶的表達，同時降低MDA 的含量，進而提高機體的抗氧化能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中抗氧化指標SOD 明顯增加，MDA 明顯降低，這提示MI/RI 大鼠的抗氧化能力明顯降低，而楊梅素則可以明顯地提高SOD 活性，同時降低MDA 活性，且楊梅素高劑量組明顯優(yōu)于陽性對照組，這提示楊梅素對MI/RI 大鼠心肌組織中抗氧化能力的提高具有明顯的促進作用。

此外近年來研究發(fā)現(xiàn)，HO-1 也具有強大的抗炎能力［20］。正常情況下，在心肌細胞發(fā)生缺血再灌注損傷后，心肌細胞可以釋放出過多的血紅素，其分泌的血紅素主要有兩個作用，一方面誘導(dǎo)巨噬細胞及粒細胞的浸潤，另一方面則可以反饋調(diào)節(jié)，誘發(fā)心肌細胞中HO-1的表達。HO-1在過量表達后，可以通過抑制炎癥細胞黏附、趨化和滲透，進而發(fā)揮一定的抗氧化作用。如Kapturczak等［21］研究發(fā)現(xiàn)，基因剔除的HO-1 小鼠血清中IgM水平會明顯增高，給予這些小鼠使用脂多糖刺激后，小鼠可釋放出高水平的IL-1、IL-6 和TNF-α等，而正常的小鼠則沒有這種反應(yīng)，這提示HO-1基因剔除的小鼠抗炎能力明顯降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中IL-6 和 TNF-α 明顯升高，這提示 MI/RI 大鼠具有明顯的炎癥反應(yīng)，而采用楊梅素治療后，大鼠IL-6和TNF-α 明顯降低，這提示楊梅素對炎癥反應(yīng)具有明顯的調(diào)節(jié)作用。同時結(jié)合HO-1 蛋白及mRNA的表達特點發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，楊梅素可以明顯提高心肌組織中HO-1蛋白及mRNA的表達水平，同時這種表達的變化特點與抗氧化指標SOD和MDA、炎性因子指標IL-6 和TNF-α 的變化特點具有一致性，這提示，楊梅素抗MI/RI 大鼠炎癥反應(yīng)，同時提高抗氧化能力可能是通過調(diào)節(jié)心肌組織中HO-1的表達而實現(xiàn)的。

綜上所述，楊梅素對MI/RI 大鼠心肌損傷具有明顯的抑制作用，其保護作用機理是通過提高心肌中HO-1蛋白及mRNA的表達，進而降低炎癥因子IL-6 和TNF-α，提高抗氧化指標SOD，降低氧化產(chǎn)物MDA實現(xiàn)的。