周其椿， 張顯波*， 李建光， 曾 圣， 閔倩雯， 陳飛雄， 楊 興

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心， 貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)屬鯉形目，鯉科，裂腹魚亞科，裸鯉屬。俗稱有湟魚、花魚、狗魚、無鱗魚。青海湖裸鯉為喜冷魚類，分布于青海湖及其支流中，克魯克湖、扎陵湖、鄂陵湖，其肉質(zhì)鮮嫩，口味極佳，是青海湖中唯一的經(jīng)濟(jì)魚類。近年來，由于自然和人為因素的影響，青海湖裸鯉資源急劇下降，甚至面臨衰竭的危險。因此，對青海湖裸鯉展開生殖生理學(xué)研究，對解析其性腺發(fā)育機(jī)制具有重要意義，為其人工擴(kuò)繁和分子遺傳育種研究奠定理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】魚類性腺發(fā)育受多個信號通路的共同調(diào)控，其中真核生物的翻譯起始因子對性腺發(fā)育必不可少。真核生物翻譯起始因子Eif5b(eukaryotic initiation factor 5b)是從原核生物、古細(xì)菌到真核生物都保守的翻譯起始因子之一，在翻譯起始過程的最后一步發(fā)揮作用。Eif5b是依賴核糖體的GTPase，與Met-tRNAi互作，共同促進(jìn)20Spre-rRNA的剪切，并且在翻譯起始的最后一步招募60S小亞基到40S大亞基，最終形成80S核糖體[1]。eif5b基因最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，酵母的突變體fun12影響多聚核糖體的形成，進(jìn)而導(dǎo)致生長緩慢，而外源重組的eif5b基因能夠互補(bǔ)該表型。隨后eif5b基因在人類[2]、果蠅[3]中被克隆。人類eif5b基因的GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變會抑制翻譯過程[2]，而果蠅中純合的eif5b突變體的幼蟲是致死的[3]。植物中報(bào)道的豌豆peif5b基因被認(rèn)為是分子伴侶[4-5]，其編碼的蛋白缺失eif5b基因的N端，僅包含C端部分序列，具有較高的熱穩(wěn)定性，能夠阻止其他蛋白的的聚集[6]。【研究切入點(diǎn)】貴州省冷水資源量巨大，水質(zhì)良好，水溫常年穩(wěn)定在11～25℃，適宜養(yǎng)殖高品質(zhì)冷水性魚類。與北方冬季嚴(yán)寒期長、南方夏季水溫偏高相比，貴州省養(yǎng)殖冷水魚普遍沒有“半年養(yǎng)半年閑”的現(xiàn)象，十分適宜青海湖裸鯉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所從青海引進(jìn)養(yǎng)殖的青海湖裸鯉已能夠完全適應(yīng)貴州養(yǎng)殖環(huán)境。然而，eif5b基因在魚類中的功能和作用未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】圍繞青海湖裸鯉卵巢中的eif5b基因克隆和功能，研究eif5b基因在青海湖裸鯉腦、垂體、鰓、心臟、肝臟、腸、脾臟、頭腎、性腺、肌肉和腎臟組織中的分布情況及在卵巢各時期的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用青海湖裸鯉從青海湖裸鯉救護(hù)中心引進(jìn)，在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所試驗(yàn)基地培育。試驗(yàn)魚于自然光周期下在22℃的恒溫循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)，投喂?jié)h業(yè)飼料，早中晚各1次。

1.2 青海湖裸鯉eif5b基因克隆

根據(jù)GenBank中報(bào)道的相關(guān)物種的eif5b的基因序列，在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成簡并引物，用此簡并引物進(jìn)行eif5b基因部分片段擴(kuò)增及測序，獲取青海湖裸鯉eif5b基因中間部分序列，并通過3′-RACE和5′-RACE(Rapid-amplifiction of cDNA ends)及與其他魚類基因組序列比對獲取eif5b基因全序列。

1.3 eif5b基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

進(jìn)化樹包括人(NP_001960.2)、小鼠(NP_775539.1)、雞(NP_001006488.1)、龜(XP_025038838.1)、非洲爪蟾(XP_018086068.1)、金線鲃(XP_016356031.1)、鯽魚(XP_026134766.1)、鯉魚(XP_018972725.1)、斑馬魚(NP_955885.1)、羅非魚(XP_031609405.1)和研究克隆的青海湖裸鯉eif5b氨基酸序列。進(jìn)化樹以NJ法采用MEGA 6.0構(gòu)建。斑馬魚Eif4g3b(XP_009304365.1)氨基酸序列作為外類群。進(jìn)化樹中數(shù)值表示隨機(jī)進(jìn)行1 000次試驗(yàn)的步展值。

1.4 脊椎動物eif5b基因的共線性分析

脊椎動物eif5b基因及其相鄰基因圖譜的構(gòu)建在Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org)網(wǎng)址上進(jìn)行分析研究。

1.5 青海湖裸鯉eif5b組織表達(dá)模式分析

解剖24月齡青海湖裸鯉，取其腦、垂體、鰓、心臟、肝臟、腸、脾臟、頭腎、性腺、肌肉和腎臟放于液氮速凍。按照RNAiso Plus操作說明提取總RNA，DNase I處理，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)eif5b在各個組織中的分布情況。以青海湖裸鯉β-actin作為內(nèi)參，以卵巢cDNA模板為陽性對照，以雙蒸水模板為陰性對照。

1.6 青海湖裸鯉eif5b基因在各時期卵巢中的表達(dá)情況

取3、6、9、12、18、24月齡的青海湖裸鯉卵巢液氮速凍，提取總RNA，合成cDNA。采用Real-time PCR檢測eif5b基因在各時期青海湖裸鯉卵巢中的表達(dá)情況。管家基因β-actin作為內(nèi)參，目標(biāo)基因mRNA的相對表達(dá)水平采用公式R= 2-△△Ct計(jì)算[7]。結(jié)果表示為Ct值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)，采用SPSS進(jìn)行顯著性分析，組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析Duncan’s post-hoc檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 青海湖裸鯉eif5b cDNA 和氨基酸全序列

基于RT-PCR和RACE分析顯示，青海湖裸鯉eif5b全長cDNA序列為2 209 bp，包括5′端501-bp的非編碼區(qū)，1 293-bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)和5′端415-bp非編碼區(qū)；開放閱讀框編碼430個氨基酸(圖1)。

2.2 脊椎動物eif5b序列對比和系統(tǒng)聚類

通過氨基酸序列的比對，eif5b在脊椎動物間有高度相似性，含有eif-5_eif-2b superfamily和W2 superfamily結(jié)構(gòu)域；克隆的青海湖裸鯉eif5b與人、小鼠、雞、龜、非洲爪蟾、金線鲃、鯽魚、鯉魚、斑馬魚、羅非魚Eif5b間的氨基酸序列相似性分別為76.2%、76.2%、76.7%、75.7%、76.0%、95.1%、93.7%、94.2%、85.8%、87.9%(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，四足類人、小鼠、雞、龜、非洲爪蟾的Eif5b氨基酸序列聚為一支，魚類金線鲃、鯽魚、鯉魚、斑馬魚、羅非魚、青海湖裸鯉的Eif5b氨基酸序列聚為一支(圖3)。

2.3 脊椎動物eif5b基因共線性

共線性分析顯示，eif5b與其鄰近基因lipt1、mitd1、mrlp30、lgy2、lygl、txndc9、revl、aff3在人、小鼠和雞中的共線性高度保守，蜥蜴的lipt1、mitd1、mrlp30、lgy2不共線，腔棘魚和斑點(diǎn)雀鱔的lgy2、lygl不共線；魚類中，除斑馬魚外，eif5b與其鄰近基因lipt1、bco1l、kalrnb高度保守；四足類和魚類只有l(wèi)ipt1和eif5b的共線性保守(圖4)。

2.4 青海湖裸鯉eif5b組織表達(dá)模式

通過RT-PCR技術(shù)分析青海湖裸鯉eif5b在成魚各個組織中的表達(dá)情況，eif5b主要表達(dá)于腦、垂體、鰓、心臟、脾臟、卵巢、精巢和腎臟(圖5)，呈泛表達(dá)模式。

圖5 青海湖裸鯉eif5b組織表達(dá)模式

2.5 青海湖裸鯉eif5b在卵巢不同發(fā)育階段的表達(dá)

Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，eif5b在3、6、9、12、18、24月齡卵巢中都存在表達(dá)，在3月齡表達(dá)量最低，6和9月齡持續(xù)顯著升高，后期持續(xù)高表達(dá)。

圖6 青海湖裸鯉eif5b在卵巢不同發(fā)育階段的表達(dá)水平

3 討論

eif5b作為翻譯起始因子，在生物的多種信號通路和器官發(fā)育中有重要作用。研究表明，eif5b在青海湖裸鯉的多個組織中有表達(dá)，說明該基因的功能是多元化的。研究首次在魚類卵巢中對該基因的表達(dá)功能進(jìn)行研究，eif5b在整個青海湖裸鯉卵巢發(fā)育過程中都存在高表達(dá)，說明eif5b在各時期卵巢發(fā)育過程中都扮演重要角色。前人在線蟲中研究顯示，性腺中Vasa基因通過招募eif5b來調(diào)控下游基因翻譯[8]，Vasa是大多數(shù)生物生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因，高表達(dá)于各級生殖細(xì)胞。3月齡雌性青海湖裸鯉卵巢開始進(jìn)行減數(shù)分裂，一般人工養(yǎng)殖條件下24月齡能夠達(dá)到性成熟。從卵巢減數(shù)分裂起始至卵巢發(fā)育成熟，eif5b都存在高表達(dá)，說明魚類eif5b很可能也與Vasa基因相偶聯(lián)，受其招募，作用于下游基因，但其具體功能和作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

研究成功克隆的青海湖裸鯉eif5b基因含有eif-5_eif-2b superfamily和W2 superfamily結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，以斑馬魚Eif4g3b作為外類群，克隆的eif5b與其它脊椎動物的eif5b聚為1支，且克隆的eif5b與其它脊椎動物的eif5b序列同源性最低為75.7%，最高達(dá)95.1%；共線性分析顯示，四足類及四足類祖先魚類腔棘魚和斑點(diǎn)雀鱔eif5b基因及相鄰基因相當(dāng)保守，蜥蜴中共線性不保守的幾個基因可能由測序拼接不完整造成。魚類的eif5b基因及相鄰基因的共線性十分保守，斑馬魚的不保守型也可能是由于測序拼接不完整造成。