張程涵， 趙會納， 余 婧， 余世洲， 許本波， 雷 波*

(1.長江大學 生命科學學院， 湖北 荊州 434025； 2.貴州省煙草科學研究院 煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室， 貴州 貴陽 550081)

0 引言

【研究意義】煙草(NicotianatabacumL.)是以收獲葉片為目標的經濟作物，是西南地區(qū)主要特種經濟作物之一。煙葉木質素含量是影響其品質的重要因素之一，木質素含量高的煙葉具有強烈刺激性、澀口，木質氣重，導致其吸食品質差[1-3]。因此，探明煙草中木質素合成的調控網絡，解析調控網絡中的關鍵調控因子，對利用基因工程改造煙草木質素含量，改良煙葉品質具有重要意義。【前人研究進展】木質素是植物細胞壁的重要組分之一，具有重要的生物學功能，如利于營養(yǎng)物質及水分在植物體內長距離運輸、增強植物細胞和組織的機械強度以及對各種脅迫的防御能力等[4]。在高等植物中，木質素生物合成途徑研究較多，木質素來源于芳香族氨基酸苯丙氨酸，經公共苯丙烷代謝途徑的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羥基化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL) 3個關鍵酶催化后形成4-香豆酰輔酶A，進入木質素分支途徑后，進一步被轉化為肉桂醇衍生物，脫氫還原形成木質素單體后合成木質素。木質素的生物合成還與苯丙烷代謝途徑的其他分支相互作用[5-6]。在木質素合成代謝途徑中，轉錄因子發(fā)揮著重要的作用，近10年研究證明，木質素的生物合成受轉錄因子NAC-MYB網絡的調控[7-8]。其中，MYB轉錄因子在木質素生物合成中的調控作用解析也成為熱點。MYB轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子，其在N端有一段51～52個氨基酸組成MYB結構域，根據所含的MYB結構域數(shù)目不同，主要分為R1-MYB、R2R3-MYB和R1R2R3-MYB 3個亞類[9]。木質素代謝合成中的MYB轉錄因子，主要是R2R3型，通過與木質素生物合成途徑關鍵酶基因啟動子區(qū)AC元件結合進行調控[10]。模式植物擬南芥的AtMYB58和AtMYB63是首次報道的木質素特異性轉錄激活因子[11]，其MYB能夠直接激活PAL、C4H和4CL等木質素生物合成基因，從而調控木質素的生物合成。AtMYB4作為阻遏物直接靶向木質素生物合成基因4CL等[12-13]，過表達AtMYB4的轉基因植株中，木質素含量降低。擬南芥AtMYB20、AtMYB42、AtMYB43和AtMYB85激活AtMYB4，激活苯丙氨酸和木質素生物合成，優(yōu)化苯丙氨酸向木質素生物合成途徑的流動[14]。玉米ZmMYB31和ZmMYB42通過調節(jié)木質素的生物合成參與苯丙烷代謝[15-16]，矮牽牛ODO1(MYB42)能夠激活參與番茄中莽草酸途徑和苯丙氨酸衍生揮發(fā)性化合物的生物合成[17]?！狙芯壳腥朦c】目前，擬南芥等植物中MYB42在木質素代謝調控中具有十分重要的作用，可調控木質素的生物合成，但未見MYB42在煙草中是否具有相似功能的研究報道。【擬解決的關鍵問題】根據AtMYB序列和煙草MYB轉錄因子序列，采用同源克隆法分離煙草中的NtMYB42基因，并對基因的結構、編碼蛋白理化性質、亞細胞定位和同源性等進行分析，為煙葉品質改良提供參考依據。

本系統(tǒng)利用RS技術和現(xiàn)狀圖的數(shù)據源對1∶10 000比例尺土地進行更新，選擇當年的衛(wèi)星數(shù)據（全色3m），同時借助GPS技術將更新范圍確定下來。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙草 栽培品種K326，由貴州省煙草科學研究院提供。

國務院于1994年頒布的《種畜禽管理條例》第15、16條規(guī)定，生產經營種畜禽的單位和個人，必須向縣級以上人民政府畜牧獸醫(yī)行政主管部門申領《種畜禽生產經營許可證》、申領《種畜禽生產經營許可證》必須具備符合良種繁育體系規(guī)劃布局要求，所用種禽合格、優(yōu)良，來源符合技術要求，并達到一定數(shù)量，要相應的畜牧獸醫(yī)技術人員，有相應的防疫措施，有相應的育種資料和記錄。因此各級畜牧業(yè)獸醫(yī)行政管理部門只有嚴格按照《種畜禽管理條例》的規(guī)定加強管理，才能及時掌握和了解本地區(qū)種畜禽來源、品系情況。從而保證種畜禽品種質量，促進養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1.1.2 試劑與試劑盒 植物組織RNA小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和EasyPure Plant Genomic DNA Kit，購自北京全式金生物技術有限公司；DL2000 marker、RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0、Taq DNA聚合酶和其他分子生物學試劑，購自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T，購自美國Promega公司；引物，由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.2 煙草葉總cDNA獲得 以K326葉片總RNA樣品0.5 μg為模版，按TaKaRa RNA PCR KitVer.3.0試劑盒說明書進行反轉錄，反轉錄后產物即為葉總cDNA。

1.2.1 核酸提取 以K326葉片為材料，按照植物組織RNA小量提取試劑盒和EasyPure Plant Genomic DNA Kit提供的方法提取總RNA和基因組DNA。

從以上分析不難看出，經濟是旅游的表象，文化是旅游的本質。從旅游發(fā)展史看出，各個時期的旅游活動都有其獨特的表現(xiàn)形式及其不同的主題傾向，但在本質上具有一個共同之處，即旅游者在旅游活動中追求的是文化享受③。

1.2.4 生物信息學分析 采用Geneious 4.85對測序序列進行拼接、開放性可閱讀框ORF(Open reading frame)查找和翻譯以及蛋白質基本性質分析；序列從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載，采用DNAMAN 5.2.2進行序列多重比對、蛋白質轉錄后修飾預測通過Expasy(http://www.expasy.org)進行在線分析，采用TMHMM[18]、TMpred與Geneious 4.85進行NtMYB42蛋白的跨膜結構預測，采用SignalP[19]進行信號肽分析等。

2 結果與分析

2.1 煙草NtMYB42基因組和cDNA的克隆

測序結果表明，NtMYB42 cDNA和基因組全長分別為1 130 bp和 2 312 bp，含有5′非翻譯區(qū)(UTR)、2個外顯子、1個內含子和3′UTR。其中，5′UTR長度為137 bp，位于基因組序列的1～137 bp，GC含量為31.2%；3′UTR長147 bp，位于基因組序列的2 166～2 312 bp，GC含量為32.0%；第1外顯子長度為263 bp，位于基因組序列的138～400 bp，第2外顯子長度為583 bp，位于基因組序列的1 585～2 165 bp，2個外顯子構成的開放性可閱讀框(ORF)為846 bp，GC含量為41.6%；內含子長度為1 182 bp，位于基因組序列的401～1 584 bp，內含子剪切符合“GT-AG”原則(圖2)。

2.2 NtMYB42基因的核苷酸序列

電泳結果顯示，K326的cDNA和基因組模板經引物NtMYB42-F和NtMYB42-R擴增出約1 100 bp(圖1 A)和2 300 bp(圖1 B)的特異條帶，與預期相符。膠回收轉化大腸桿菌后，經菌液PCR檢測后挑選陽性克隆子送上海生工有限公司測序。

1.2.3 煙草NtMYB42基因的克隆 以公布的擬南芥MYB42(AtMYB42)轉錄因子的氨基酸序列為檢索序列，利用Geneious 4.85 (Biomatters Ltd.)整合的BLAST程序對所有煙草MYB基因家族160多個基因編碼區(qū)和基因組序列進行序列多重比對，選擇與AtMYB42同源性最高的序列，將其命名為NtMYB42，選擇NtMYB42基因的特異位點進行引物設計，設計NtMYB42基因全長cDNA和基因組DNA序列擴增的引物NtMYB42-F(5′-CACCGAGAAAAGTGAGAACTTTACAAGAAAAGTTG-3′)/NtMYB42-R(5′-CTTCCTAGTACTATAGACATGATACATTTG-3′)。以煙草葉片cDNA第一鏈和基因組總DNA各1 μL為模版，采用50 μL PCR反應體系，擴增NtMYB42基因全長cDNA和基因組DNA序列。PCR擴增cDNA的參數(shù)：94℃預變性4 min，35個循環(huán)(94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min)，72℃℃保溫10 min?；蚪MDNA擴增時，其延伸的時間增至3 min。將獲得的PCR產物膠回收后，連接pGEM-T載體，挑選菌液PCR檢測的陽性單克隆子測序。

圖1 NtMYB42 cDNA(A)和基因組(B)的PCR擴增圖譜

2.3 NtMYB42蛋白的理化性質與轉錄后修飾位點

施工單位的建造能力水平與造價成本相關，如果施工單位整體的業(yè)務能力水平高，則可以降低因缺陷返工等因素造成的額外費用。施工單位業(yè)務水平強，可以縮短施工周期，保證建筑產品質量，提升施工單位在建筑市場的形象。

NtMYB42蛋白含有281個氨基酸，分子量為31.79 kD，理論等電點pI為5.18。其中，極性氨基酸95個，比重為37.48%；酸性氨基酸44個，比重為16.67；堿性氨基酸34個，比重為14.49%。NtMYB42蛋白中，亮氨酸(Leu)占比最大，為32個，占整個蛋白序列的11.41%；其次是絲氨酸(Ser)和天冬氨酸(Asp)，均為24個，各占整個蛋白序列的8.54%。NtMYB42蛋白的原子組成為C1380H2185N393O441S14，消光系數(shù)在280 nm時為46 115，不穩(wěn)定系數(shù)為47.47，是不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為79.11，總平均親水性為-0.642。經NetGly 1.0分析，NtMYB42蛋白存在N174、N184和N2353個可能的N-糖基化修飾位點。經NetPhos分析，NtMYB42中存在14個絲氨酸激酶磷酸化位點、3個蘇氨酸激酶磷酸化位點和1個酪氨酸激酶磷酸化位點(圖3)。說明，NtMYB42蛋白能夠被激酶所磷酸化，從而實現(xiàn)其功能的調控。NtMYB42蛋白在150～200個氨基酸間存在多個絲氨酸位點，表明在該區(qū)域可能存在1個密集的絲氨酸磷酸化調控位點，可作為激酶底物進行體外磷酸化試驗證實。

2.4 NtMYB42蛋白跨膜區(qū)域與拓撲結構的預測

經TMHMM、TMpred與Geneious 4.85分析，NtMYB42蛋白不存在跨膜結構；經SignalP分析，NtMYB42未發(fā)現(xiàn)明顯的信號肽剪切位點。NtMYB42的亞細胞定位結果在幾個預測工具中差異較大，PSORT預測NtMYB42位于細胞質中，WoLFPSORT則預測NtMYB42位于細胞核中。研究表明，AtMYB42作為轉錄因子均在細胞核中行使功能，考慮到蛋白N末端序列的保守性，NtMYB42蛋白很可能在細胞核中執(zhí)行功能，是否在其他細胞結構中存在一定的功能還需要進一步進行亞細胞定位分析。SOPMA對NtMYB42蛋白進行二級結構分析，NtMYB42蛋白中隨機卷曲最多，占53.02%，其次是α-螺旋，占32.74%，延伸鏈和β-折疊分別為7.69%和 6.54%。轉錄因子MYB功能結構域位于蛋白的 N末端?？梢?，α-螺旋結構對正確行使 MYB轉錄因子的綁定功能具有重要意義，這部分位點的突變可能導致功能差異的等位基因出現(xiàn)，對調控下游次生代謝途徑基因具有重要作用。

2.5 NtMYB42基因的同源性

將NtMYB42蛋白序列提交至NCBI進行BLAST比對，并下載其他植物同源的MYB42及其他MYB蛋白序列進行多重比對結果表明，NtMYB42蛋白與番茄SlMYB42蛋白〔MYB-like protein ODO1(XP_004245722.1)〕的一致性最高，達82.6%；與矮牽牛PnODO1蛋白的一致性其次，為79.2%；與其他植物MYB42蛋白的一致性也較高，包括葡萄(Vitisvinifera)的VvMYB42(XP_002264150.2)、可可(Theobromacacao)的TcMYB4(EOY24459.1)、楊樹(Populustrichocarpa)的PtMYB42(XP_002303526.3)及大豆(Glycinemax)的GmMYB42(XP_003516672.1)等。表明，克隆的MYB42為煙草的MYB轉錄因子。MYB轉錄因子DNA綁定結構域基序在所有比對的植物中均十分保守，蛋白質水平多重比對結果(圖4)表明，MYB42蛋白在N端極其保守，說明N端與MYB轉錄因子密切相關。

3 討論

木質素是煙草細胞壁的主要成分之一，是影響煙株水、有機物和防御系統(tǒng)的關鍵因素，其含量過高或過低都不利于煙葉生長和品質的形成。在木質素合成代謝途徑調控中，NAC蛋白作為主開關協(xié)調調控完整細胞壁的形成，包括纖維素、半纖維素和木質素[20]。AtMYB轉錄因子作為二級調控開關，從多水平轉錄調控碳通量在木質素和其他類黃酮物質間的流動[21]，因此MYB轉錄因子對木質素含量精細調控更為重要。AtMYB42在擬南芥木質部組織中優(yōu)勢表達，抑制AtMYB42表達會顯著降低木質素生物合成相關基因的表達，在其對應突變體植株中木質素含量顯著減少[14]。在擬南芥中過表達ZmMYB42，顯著降低S-木質素含量，提高H-木質素和G-木質素含量[21]。研究利用同源克隆策略，從栽培煙草K326中克隆得到NtMYB42基因的全長cDNA和基因組序列，編碼281個氨基酸，經BLAST分析，其與其他植物來源的MYB42具有較高的同源性，在蛋白水平與SlMYB42的一致性達82.6%，經與其他植物同源的MYB42及其他MYB蛋白序列多重比表明，克隆的NtMYB42蛋白與番茄MYB-like protein ODO1、矮牽牛PnODO1、其他植物AtMYB42等具有較高的同源性，推測其具有相似功能，說明克隆的NtMYB42基因是木質素代謝途徑調控的重要候選基因。NtMYB42在煙草中如何調控木質素生物合成，是否與擬南芥中直接調控MYB4抑制其他競爭代謝途徑以優(yōu)化木質素生物合成，從而控制碳流入苯丙酸途徑相同，還需要進一步深入研究。

4 結論

從栽培煙草K326中克隆得到NtMYB42基因的全長cDNA和基因組序列，編碼281個氨基酸。NtMYB42與其他植物來源的MYB42具有較高的同源性，是番茄SlMYB42、矮牽牛PnODO1和擬南芥AtMYB42的同源基因，推測其具有相似功能即調控煙草木質素生物合成途徑，可為煙草品質改良提供參考依據。

DOI：10.3389/fpls.2017.00943.

DOI：10.1038/srep28502.

DOI：10.1056/NEJM199001043220121.

DOI：10.1038/ncomms9635.