趙曉珍， 柏自琴， 王 荔， 李興忠， 鄭 偉， 王 彬

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹科學(xué)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006)

0 引言

【研究意義】火龍果潰瘍病是一種真菌性病害，危害大，對(duì)貴州火龍果潰瘍病病原菌進(jìn)行鑒定，并開展生物學(xué)特性研究，對(duì)該病害的防治及提高貴州火龍果品質(zhì)具有重要的實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】火龍果潰瘍病在火龍果上發(fā)生最為普遍和嚴(yán)重，在我國(guó)廣西、廣東、臺(tái)灣、貴州等地普遍發(fā)生[1-5]，在馬來西亞、以色列、美國(guó)等國(guó)家均有發(fā)生[6-8]?；瘕埞麧儾≈饕：瘕埞l及果實(shí)，發(fā)病初期在莖及果實(shí)上形成褪綠色小點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)病斑連成片，后期病斑突起，濕度大時(shí)，病斑邊緣形成水浸狀，不斷擴(kuò)大，腐爛，潰瘍病的發(fā)生嚴(yán)重影響火龍果的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，火龍果潰瘍病病原菌研究受到關(guān)注，有研究表明，在馬來西亞以及我國(guó)臺(tái)灣、廣東、海南等地引起火龍果潰瘍病的病原菌為Neoscytalidiumdimidiatum[9-10]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】貴州省火龍果種植面積約6 500 hm2，規(guī)模位居全國(guó)第5位，種植主要分布在羅甸、鎮(zhèn)寧、關(guān)嶺、貞豐、望謨等低熱河谷地區(qū)。隨著貴州火龍果種植面積的不斷擴(kuò)大，火龍果病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，主要病害有炭疽病、黑斑病、枯斑病等[11-13]。近幾年，貴州火龍果主產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生火龍果潰瘍病，嚴(yán)重影響了貴州火龍果的品質(zhì)和產(chǎn)量[1]，而目前未見貴州火龍果潰瘍病的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用常規(guī)組織分離法、形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合，對(duì)火龍果病原菌進(jìn)行分離、鑒定，并開展病原菌生物學(xué)特性研究，明確引起貴州省火龍果潰瘍病的病原，為該病的防治及病原菌的碳氮源代謝研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株樣品 火龍果品種為黔蜜龍，病樣于2018年采于貴州省鎮(zhèn)寧縣。

1.1.2 試劑與儀器 Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒為上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)，Takara Ex Taq Hot Start Version為寶生物工程有限公司生產(chǎn)，D-葡萄糖、硫酸鈉、磷酸二氫鉀均為Sigma公司生產(chǎn)。Biolog PM系統(tǒng)，PMl、PM2和PM3微孔板，F(xiàn)F-IF接種液。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采集病樣植株，用自來水和無菌水沖洗干凈后，采用常規(guī)組織分離法[14]取病健交界處3 mm×3 mm的組織，于75%的酒精中浸泡3 s，5%次氯酸鈉溶液浸泡4～5 min，再用滅菌水洗4～5次，于滅菌濾紙上干燥后置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平面上，于26℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待組織周圍長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化。

1.2.2 病原菌的致病性測(cè)定 將分離出的H1菌株于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣取5 mm的菌餅，采用針刺接種法將菌餅接種于刺傷的火龍果莖上，以接種無菌PDA培養(yǎng)基塊的火龍果莖作對(duì)照，置于保鮮盒中，于28℃培養(yǎng)箱中恒溫保濕培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，觀察發(fā)病情況，對(duì)回接試驗(yàn)中發(fā)病的火龍果莖進(jìn)行再次分離、鑒定，根據(jù)柯赫氏法則確定H1菌株是否為致病菌株。

1.2.3 病原菌的鑒定

1) 形態(tài)學(xué)鑒定。將純化后的致病菌株H1接種于PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，顯微鏡觀察分生孢子形態(tài)，并記錄拍照。

2) 分子生物學(xué)鑒定。采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株H1，收集菌絲，采用Ezup柱式真菌基因組DNA試劑盒，按說明書提取菌株H1的基因組DNA；采用真菌ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[15]對(duì)H1菌株基因組DNA進(jìn)行rDNA-ITS基因擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物工程有限公司純化后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI進(jìn)行比對(duì)分析，獲得高相似性菌株，采用MAGA 6.0軟件比對(duì)校正后，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 病原菌生物學(xué)特性鑒定

1) 溫度。將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的病原菌，用直徑為5 mm的滅菌打孔器打取菌餅，將菌餅接種于備用PDA培養(yǎng)基中，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，每處理重復(fù)3次，用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑。

2) pH值。將直徑為5 mm的病原菌菌餅分別接種于pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，每處理重復(fù)3次，用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑。

3) 光照。設(shè)置5種光照條件，分別為24 h黑暗、24 h光照、12 h黑暗/12 h光照、紫外光5 min+24 h光照、紫外光+12 h黑暗/12 h光照。將直徑為5 mm的病原菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，再分別置于不同光照條件下培養(yǎng)3 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑。

4) 碳氮源的利用。采用Biolog表型芯片技術(shù)，參考WANG等[16-17]的方法測(cè)定火龍果潰瘍病菌對(duì)PM碳氮源代謝。將致病菌株H1于PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗培養(yǎng)3 d，用少量無菌蒸餾水洗下分生孢子，配制1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液。用FF-IF接種液調(diào)整孢子懸浮液濃度，使其透光度為62%T(T為Biolog標(biāo)準(zhǔn)濃度單位)，將孢子懸浮液分別接種至PMl、PM2微孔板中，每孔100 μL；往62%T孢子懸浮液中加入葡萄糖，磷酸二氫鉀和硫酸鈉，使其在孢子懸浮液中的終濃度分別為100 mmol/L、5 mmol/L和2 mmol/L，再將此孢子懸浮液接種至PM3微孔板中，每孔100 μL。將PMl、PM2和PM3板置Biolog系統(tǒng)培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)5 d，由OmniLog 2.4系統(tǒng)每15 min讀數(shù)1次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用MAGA 6.0對(duì)火龍果潰瘍病病菌的rDNA-ITS序列數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和構(gòu)建進(jìn)化樹，通過SPSS 24進(jìn)行單因素方差分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差(DMRT)法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果潰瘍病癥狀

從圖1看出，火龍果潰瘍病主要危害火龍果莖及果實(shí)，發(fā)病初期在莖及果實(shí)上形成褪綠色小點(diǎn)，逐步擴(kuò)大形成褪綠斑，嚴(yán)重時(shí)病斑連成片，褪綠斑逐漸變成黃色和紅色，后期病斑突起，濕度大時(shí)易受其他病原侵入，病斑邊緣不斷擴(kuò)大，黃化腐爛。

2.2 病原菌分離及致病性

采用組織分離法分離得到優(yōu)勢(shì)菌株H1，采用刺傷接種法將分離純化后的菌株H1接種至健康火龍果枝條上，接種5 d后癥狀明顯，接種菌餅部位均有明顯病斑，且周圍產(chǎn)生褪綠小點(diǎn)；8 d后接種部位逐漸擴(kuò)大，病斑凸起明顯；18 d后病斑周圍逐步擴(kuò)大黃化腐爛，與田間癥狀相似，而對(duì)照未見明顯病斑。從接種后發(fā)病的部位重新分離，觀察菌落、孢子形態(tài)等結(jié)果與菌株H1一致，說明分離出的H1菌株為火龍果潰瘍病病原菌。

圖1 火龍果潰瘍田間癥狀

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)特征鑒定 H1菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣較整齊，在28℃條件下生長(zhǎng)迅速，氣生菌絲發(fā)達(dá)，細(xì)絨毛狀，菌落初期灰白色(圖2A-B)；3 d以后培養(yǎng)基逐漸變黑，7 d時(shí)培養(yǎng)基完全變?yōu)楹诰G色(圖2C-D)。病原菌在培養(yǎng)過程中，菌絲會(huì)斷裂形成節(jié)孢子鏈，節(jié)孢子無隔膜或有隔膜(圖3A)；分生孢子形態(tài)多樣，有圓形、橢圓形、桿狀等，有隔膜或無隔膜(圖3B)。根據(jù)H1菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，與報(bào)道的火龍果潰瘍病原菌新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidiumdimidiatum)相似[3,10]，初步確定致病菌株H1為新暗色柱節(jié)孢菌。

注：A、B分別為培養(yǎng)3 d菌落的正、反面，C、D分別為培養(yǎng)7 d菌落的正、反面。

注：A為節(jié)孢子鏈，B為分生孢子。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 將致病菌株H1的rDNA-ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果(圖4)顯示，菌株H1與Neoscytalidiumdimidiatum(登錄號(hào)：HQ439174.1，JX473739)的相似性達(dá)99%以上。選取已報(bào)道的火龍果潰瘍病菌(Neoscytalidiumdimidiatum)(登錄號(hào)：JX524168.1、KF812550)[10, 18]以及在李和杏上發(fā)現(xiàn)的Neoscytalidiumdimidiatum[19-20](登錄號(hào)分別為MH676062、MK788362)，采用MAGA 6.0軟件經(jīng)過比對(duì)校正后，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖4)表明，致病菌株H1與Neoscytalidium dimidiatum處于同一分支，與Neoscytalidiumdimidiatum的異名屬Scytalidium的不同種處于不同分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，確定引起貴州火龍果潰瘍病的病原為新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidiumdimidiatum)。

圖4 菌株H1基于rDNA-ITS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 病原菌生物學(xué)特性

2.4.1 不同溫度下病原菌的生長(zhǎng)情況 從表1看出，病原菌在PDA平板上生長(zhǎng)3 d時(shí)，不同溫度下菌落直徑差異明顯，病原菌菌絲在20～40℃下均能生長(zhǎng)，最適溫度為28℃，菌落直徑達(dá)71.50 mm，顯著大于其他溫度條件。溫度高于35℃和低于20℃時(shí)生長(zhǎng)受到明顯抑制；45℃和15℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)。說明病原菌相對(duì)耐高溫。

2.4.2 不同pH下病原菌的生長(zhǎng)情況 從表2看出，培養(yǎng)3 d時(shí)火龍果潰瘍病病原菌在培養(yǎng)基pH 4～10中均可生長(zhǎng)，最適pH為6～7，菌落平均直徑分別為73.6 mm和72.5 mm，無顯著性差異。pH為10時(shí)菌落平均直徑為27.3 mm， pH為4時(shí)為59.5 mm。

表1 病原菌在不同溫度下生長(zhǎng)的菌落直徑

表2 火龍果潰瘍病病原菌在不同pH下生長(zhǎng)的菌落直徑

2.4.3 不同光照條件病原菌的生長(zhǎng)情況 從表3看出，火龍果潰瘍病病原菌在不同光照條件下均能生長(zhǎng)，而在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、光暗交替條件下病原菌菌落大小有顯著差異。連續(xù)黑暗條件下菌落直徑顯著大于光照和光暗交替條件。說明光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但短時(shí)間的紫外光照射對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

表3 火龍果潰瘍病病原菌在不同光照條件下生長(zhǎng)的菌落直徑

2.4.4 碳氮源種類利用 通過代謝表型組學(xué)分析(圖5)，火龍果潰瘍病病原菌對(duì)PMl、PM2微孔板中190種碳源物質(zhì)的平均利用率為18.42%，利用較好的碳源為b-甲基-D-葡萄糖苷、L-半乳糖酸-g-內(nèi)酯、D-半乳糖醛酸、丙二酸等32種。PM3微孔板中95種氮源物質(zhì)的平均利用率為52.63%，利用較好的為L(zhǎng)-色氨酸、丙氨酸-天冬氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺、丙氨酸-蘇氨酸、甘氨酸-天冬酰胺等32種。對(duì)PMl、PM2微孔板中利用較多的碳源物質(zhì)分別為12種和20種，對(duì)PM3微孔板中氮源物質(zhì)利用較多的有32種(表4)。

圖5 火龍果潰瘍病菌對(duì)PM1、PM2微孔板中碳源及PM3微孔板中氮源的代謝圖譜

3 討論

火龍果潰瘍病是火龍果上發(fā)生最為嚴(yán)重的病害之一，在馬來西亞、以色列、弗洛里達(dá)州等地及我國(guó)臺(tái)灣、廣東、廣西、海南均有報(bào)道[4-10]，病原主要為新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidiumdimidiatum)。本研究通過分離、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察以及ITS序列分析，明確引起貴州火龍果潰瘍病的病原為新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidiumdimidiatum)，與已報(bào)道的火龍果潰瘍病病原一致。張榮等[21]研究表明，火龍果潰瘍病在病原菌溫度為32～34℃，pH為3～4的酸性環(huán)境下生長(zhǎng)最快。易潤(rùn)華等[10]研究表明，火龍果潰瘍病病原菌在25～35℃為適宜生長(zhǎng)溫度，30℃為最佳生長(zhǎng)溫度，pH為8時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，光照促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，黑暗條件利于產(chǎn)孢。戴俊等[22]研究表明，火龍果潰瘍病病原菌最佳生長(zhǎng)溫度為28℃，生長(zhǎng)環(huán)境偏酸性。本研究結(jié)果表明，貴州火龍果潰瘍病病原菌在20～40℃均能生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)溫度為28℃，溫度在35℃時(shí)病原菌落明顯大于20℃，即病原菌較耐高溫；病原菌在pH 4～10均可生長(zhǎng)，最適宜生長(zhǎng)的pH為6～7，生長(zhǎng)環(huán)境偏酸性；黑暗條件利于病原菌的生長(zhǎng)，與以上報(bào)道的病原菌適宜高溫、偏酸性環(huán)境的整體趨勢(shì)一致，但仍然存在差異，這可能與各地生產(chǎn)環(huán)境差異有一定關(guān)系。

4 結(jié)論

貴州火龍果潰瘍病病原為新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidiumdimidiatum)；病原菌較耐高溫，最佳生長(zhǎng)溫度為28℃，最適宜生長(zhǎng)的pH為6～7，生長(zhǎng)環(huán)境偏酸性；黑暗條件利于病原菌的生長(zhǎng)。火龍果潰瘍病原菌對(duì)PMl、PM2微孔板中190種碳源物質(zhì)的平均利用率為18.42%，利用較好的碳源為b-甲基-D-葡萄糖苷、L-半乳糖酸-g-內(nèi)酯、D-半乳糖醛酸、丙二酸等32種；對(duì)PM3微孔板中95種氮源物質(zhì)的利用率為52.63%，利用較好的為L(zhǎng)-色氨酸、丙氨酸-天冬氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺、丙氨酸-蘇氨酸、甘氨酸-天冬酰胺等32種。研究結(jié)果對(duì)貴州火龍果潰瘍病的防治及潰瘍病菌與火龍果植株互作過程中病原菌的碳氮源代謝研究奠定了理論依據(jù)。