王 堯，張小飛,2*，鄒俊波,2，賈妍卓，王昌利,2*，史亞軍,2，郭東艷,2

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，咸陽 712046

高血壓是一種常見的多發(fā)性疾病，其主要特征是全身動脈壓升高，由多基因遺傳、環(huán)境及其他危險因素相互作用而導(dǎo)致的全身性疾病[1]。理論和臨床實踐表明：可將高血壓病納入中醫(yī)的“頭痛”、“眩暈”、“肝風(fēng)”等這類病證辨證論治。中醫(yī)憑借整體論治，標(biāo)本兼顧等優(yōu)勢，在對降低高血壓病患者血壓、保護(hù)靶器官、提高生活質(zhì)量具有重要作用。

當(dāng)歸是臨床中應(yīng)用較為廣泛的一味中藥，味甘平、性溫，有“十方九歸”的說法。研究表明：當(dāng)歸中含有揮發(fā)油、多糖類、水溶性、油脂類及維生素類等多種化學(xué)成分。當(dāng)歸中的揮發(fā)油是對血管起解痙攣作用的主要活性成分，其中蒿本內(nèi)脂是活性最強的成分[2,3]。然而當(dāng)歸揮發(fā)油具有降壓作用的藥效物質(zhì)以及其作用途徑尚不清楚。目前，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索藥物的作用機理研究成熟，并獲得成功[3]。故采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究當(dāng)歸揮發(fā)油主要降壓的藥效物質(zhì)和靶點通路，為臨床使用提供理論依據(jù)，本文研究流程見圖1.

1 方法

1.1 當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分的測定

本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法測定當(dāng)歸揮發(fā)油的化學(xué)成分。氣相色譜條件為：安捷倫HP-5ms(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細(xì)管柱，高純He，進(jìn)樣量1.5 μL，無分流，流速為1 mL/min，程序升溫80 ℃(保持時間：0 min)，升溫3 ℃/min至167 ℃(保持時間：2.5 min)，升溫2 ℃/min至202 ℃(保持時間：0 min)，升溫4 ℃/min至280 ℃(保持時間：15 min)。

質(zhì)譜條件為：EI離子源、電子能量70 ev、離子源溫度230 ℃、MS四極體溫度150 ℃、溶劑延遲2.5 min、質(zhì)譜掃描模式全掃描、掃描范圍30～400 amu。

1.2 當(dāng)歸揮發(fā)油化合物的鑒定

數(shù)據(jù)處理由Data Analysis軟件完成，將其閾值調(diào)整為14，對當(dāng)歸揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行篩選。所分辨的質(zhì)譜在NIST14標(biāo)準(zhǔn)譜庫中檢索，根據(jù)匹配度、保留指數(shù)和文獻(xiàn)已報道物質(zhì)進(jìn)行核對。保留指數(shù)的測定采用相同的氣相色譜條件測定正構(gòu)烷烴(C8～C40)的保留時間，自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(AM-DIS)根據(jù)正構(gòu)烷的保留時間，自動計算出當(dāng)歸中各揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)。

式中：tR(x)、tR(n)、tR(n+1)分別表示待測化合物，含碳數(shù)n和碳數(shù)n+1的正構(gòu)烷烴的保留時間且tR(n)

1.3 當(dāng)歸揮發(fā)油主要活性成分作用靶點以及高血壓疾病相關(guān)靶點的獲取

利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲取當(dāng)歸揮發(fā)油相關(guān)成分靶點共計1 081個，剔除重復(fù)項625個。通過Mendelian人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫OMIM(https://www.omim.org/)獲得高血壓相關(guān)靶點236個。DisGENET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)獲得高血壓相關(guān)靶點723個；剔除重復(fù)項，共計高血壓相關(guān)靶點792個。并將高血壓相關(guān)靶點和當(dāng)歸揮發(fā)油潛在作用靶點交互篩選出共同靶點。

1.4 當(dāng)歸揮發(fā)油活性成分—高血壓疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Cytoscape v3.7.1建立當(dāng)歸揮發(fā)油活性成分—高血壓靶點網(wǎng)絡(luò)圖。利用該軟件中的“Network analyzer”功能，分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，主要考察其?jié)點度值分布(node degree distribution)和介數(shù)中心性(betweenness centrality)2個重要的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。度值反映節(jié)點與其他節(jié)點之間的連接數(shù)；介數(shù)中心性是經(jīng)過該節(jié)點的路徑數(shù)與網(wǎng)絡(luò)中最短路徑總數(shù)的比值；度值和介數(shù)是量化節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性的拓?fù)鋮?shù)[4]。最后，利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩詫Ξ?dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓的主要成分進(jìn)行分析。

1.5 靶蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建

為研究當(dāng)歸揮發(fā)油與降壓靶點之間的相互作用，在STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)平臺構(gòu)建其靶蛋PPI網(wǎng)絡(luò)。物種設(shè)為“Homo sapiens”，最低相互作用的閥值設(shè)為中等置信度0.4“Medium confidence”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到蛋白相互作用，下載其tsv文件。通過Cytoscape v3.7.1進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治龊Y選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶蛋白。

1.6 信號通路與生物過程分析

運用Rstudio軟件R語言編程中的clusterProfiler程序包對當(dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓的靶基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析和Gene Ontology(GO)生物過程富集，分析當(dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓作用靶點的主要信號通路和生物過程，并利用R語言編程進(jìn)行繪圖分析。

1.7 分子對接

分子對接(Molecular docking)是一種基于預(yù)測配體與其相結(jié)合受體位點的計算方法，是藥物設(shè)計的重要技術(shù)[5,6,7]?；诨钚猿煞趾Y選出兩方中核心活性成分與靶標(biāo)，采用Discovery Studio 4.5 Client軟件中的LibDock模塊進(jìn)行分子對接，并得出對接得分(Score)值，得分值越大，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。蛋白下載于PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)，蛋白經(jīng)加氫、準(zhǔn)備、賦予力場后,定義活性位點。候選化合物下載于PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，保存為SDF格式。分子對接為揭示核心成分作用機制、藥理復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析及當(dāng)歸揮發(fā)油功效機制奠定了基礎(chǔ)。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸主要活性成分

通過GC—MS測定出當(dāng)歸揮發(fā)油化合物共20個(見表1)，圖2所示為當(dāng)歸揮發(fā)油離子質(zhì)譜圖。

表1 當(dāng)歸揮發(fā)油主要活性成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖2 當(dāng)歸揮發(fā)油成分離子圖

2.2 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將625個藥物靶點和792個高血壓相關(guān)靶點交互共得到115個共同靶基因(見圖3)。將115個靶基因作為當(dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓靶點，建立當(dāng)歸揮發(fā)油活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖。如圖4所示，共有134個節(jié)點，398條邊；綠色節(jié)點為當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分，粉色節(jié)點為當(dāng)歸揮發(fā)油對應(yīng)的高血壓節(jié)點，398條邊代表了化學(xué)成分與靶點的相互作用。

圖3 當(dāng)歸揮發(fā)油作用靶點與高血壓疾病靶點交集的韋恩圖

圖4 當(dāng)歸揮發(fā)油成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析

當(dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓疾病靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)有114個節(jié)點(其中有1個靶蛋白與其他蛋白未發(fā)生相互作用)，1 080條相互作用連線(見圖5)。對排序均在前15的度值和介數(shù)的靶蛋白進(jìn)行交集，共篩選出10個度值和介數(shù)的靶蛋白，提示這些靶蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，可能是當(dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓的關(guān)鍵靶點(見表2)。

圖5 當(dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓的靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 關(guān)鍵靶點拓?fù)鋮?shù)

2.4 KEGG信號通路分析

將當(dāng)歸揮發(fā)油115個高血壓疾病靶點在KEGG信號通路富集，根據(jù)P<0.05篩選到122條通路。如圖6所示列出了KEGG信號通路的前15條；其中有21個靶點參與了神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，有20個靶點參與了cGMP-PKG信號通路，20個靶點參與了鈣信號通路，15個靶點參與了糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，15個靶點參與了HIF-1信號通路。

圖6 KEGG信號通路圖

2.5 GO生物過程分析

將當(dāng)歸揮發(fā)油115個高血壓疾病靶點在GO生物過程富集，根據(jù)P<0.05篩選得：BP生物過程富集到1 779個結(jié)果，CC細(xì)胞組成富集到54個結(jié)果，MF分子功能富集到165個結(jié)果。GO分析顯示115個高血壓疾病靶點在生物過程中顯著富集(BP，圖7A～C)，包括有32個靶點參與的血管循環(huán)系統(tǒng)(vascular process in circulatory system)，有28個靶點參與的管徑的調(diào)節(jié)(regulation of tube diameter)，有28個靶點參與的血管管徑的調(diào)節(jié)(regulation of blood vessel diameter)，有28個靶點參與調(diào)節(jié)血壓(regulation of blood pressure)，有24個靶點參與的血管內(nèi)徑負(fù)調(diào)控(negative regulation of blood vessel diameter)等過程。細(xì)胞成分(CC，圖8ABC)分析表明，凹陷(caveola)，質(zhì)膜筏(plasma membrane raft)，膜筏(membrane raft)，膜微域(membrane microdomain)，膜區(qū)(membrane region)等部分都是分類的。就分子功能而言(MF，圖9ABC)，有12個靶點參與了血紅素結(jié)合(heme binding)以及四吡咯結(jié)合(tetrapyrrole binding)，有11個靶點參與了氧化還原酶活性通過與分子氧的結(jié)合或還原，作用于成對的供體上(oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen)，有7個靶點參與了核受體活性(nuclear receptor activity)和轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合(transcription factor activity,direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)等過程。

圖7 生物過程富集圖

圖8 細(xì)胞組成富集圖

圖9 分子功能富集圖

2.6 分子對接結(jié)果分析

運用Discovery Studio 4.5 Client將篩選出來的關(guān)鍵靶點與對應(yīng)核心成分進(jìn)行對接。運用LibDock模式進(jìn)行對接，對接結(jié)果如表3所示，其中度值最大的ATK1與成分1,4-Benzenediol,2,3,5-trimethyl-對接穩(wěn)定，得分值為77.054 3，接近于陽性藥對接得分值。圖10A為靶點AKT1與成分1,4-Benzenediol,2,3,5-trimethyl-對接結(jié)果圖；B為靶點VEGFA與成分1,4-Benzenediol,2,3,5-trimethyl-對接結(jié)果圖；C為靶點MAPK3與成分(1R,4R,4aS,8aR)-4,7-dimethyl-1-(prop-1-en-2-yl)-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthalene對接結(jié)果圖；D為靶點ALB與成分1,4-Benzenediol,2,3,5-trimethyl-對接結(jié)果圖；E為靶點SRC與成分(E)-3-butylidene-4,5-dihydroisobenzofuran-1(3H)-one對接結(jié)果圖。

圖10 核心成分與關(guān)鍵靶點對接結(jié)果圖

表3 分子對接結(jié)果

3 討論

高血壓是導(dǎo)致心腦血管疾病的一個重要因素之一，常引起心、腦、腎三臟的并發(fā)癥。誘發(fā)血壓升高的機制相對比較復(fù)雜，有研究表明當(dāng)歸揮發(fā)油對高血壓疾病的防治發(fā)揮一定的作用。主要通過抑制血管炎癥反應(yīng)[8]、調(diào)節(jié)胰島素信號通路及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路相關(guān)miRNA的表達(dá)[9]；明顯降低SHRs的收縮壓，改善心肌組織形態(tài)等途徑對高血壓病起治療作用[10]，而且當(dāng)歸揮發(fā)油對血管內(nèi)皮還具有一定的保護(hù)作用[11]。

本文利用分子對接技術(shù)將篩選出來的當(dāng)歸揮發(fā)油核心活性成分與關(guān)鍵靶點進(jìn)行對接，對接結(jié)果顯示對接穩(wěn)定。其中(E)-3- butylidene-4,5-dihydroisobenzofuran-1(3H)-one(藁本內(nèi)酯)含量最高，可通過降低氧化應(yīng)激性損傷以及抗細(xì)胞凋亡、清除體內(nèi)氧自由基、緩解腦細(xì)胞的損傷而發(fā)揮降壓作用[11]。此外本研究顯示tetrasiloxane,decamethyl-(十甲基四硅氧烷)、1,4-benzenediol,2,3,5-trimethyl-(三甲基氫醌)、butanoic acid,4-methoxy-,methyl ester(甲氧基丁酸甲酯)等成分也發(fā)揮降壓的作用，提示這些成分可能為當(dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓的新成分。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)AKT1、VEGFA、MAPK3、ALB、SRC等是當(dāng)歸揮發(fā)油降壓的關(guān)鍵靶點。AKT1是一種絲氨酸(蘇氨酸)激酶，在細(xì)胞代謝、存活、周期調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Miao等[12]在對高血壓心肌纖維化疾病的研究中：表明AKT1的表達(dá)和活化可以促進(jìn)AngeⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化，提示AKT1在高血壓心肌纖維化中發(fā)揮作用。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)是一種強效且具有特異性的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂劑，與其受體結(jié)合可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，增加微血管的通透性。Wang等[13]體內(nèi)實驗表明：血管VEGF可以刺激血管的發(fā)生和生長，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油能降低血清中VEGF的水平，說明其降壓作用于血清中的VEGF水平有關(guān)。尿ALB與高血壓性腎損害的進(jìn)展密切相關(guān)，Li[14]研究表明：尿Alb水平有助于評估高血壓患者早期腎損傷；也有研究表明尿液UmAlb/Ucr 的變化比血清中Scr及BUN的變化發(fā)生更早，因此能準(zhǔn)確、敏感地反映早期高血壓腎損害的情況[15]。SRC酪氨酸蛋白激酶是一個非受體型原癌基因酪氨酸激酶，Zeng等[16]論述：SRC通過不同信號途徑對血壓產(chǎn)生影響，對血壓具有雙向調(diào)節(jié)作用。

本研究為了分析當(dāng)歸揮發(fā)油降壓的治療靶點所涉及的信號通路和生物過程，對靶基因進(jìn)行了GO功能富集和KEGG信號通路分析，GO功能富集發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油治療高血壓的生物過程包括循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、管徑調(diào)節(jié)、血管大小的調(diào)節(jié)、血管直徑的調(diào)節(jié)、血壓調(diào)節(jié)、血管直徑負(fù)調(diào)節(jié)、血管收縮、血液循環(huán)調(diào)節(jié)、對氧含量的反應(yīng)、第二信使介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以發(fā)現(xiàn)這些生物過程在降壓過程中發(fā)揮重要作用。KEGG通路富集到神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、cGMP-PKG信號通路，鈣信號通路，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，HIF-1信號通路等多條通路。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路是與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號通路有關(guān)的所有受體和配體在質(zhì)膜上的集合，調(diào)節(jié)生理節(jié)律、內(nèi)分泌、情緒、學(xué)習(xí)、記憶等，內(nèi)分泌紊亂是高血壓的常見病因；此外不良的情緒也會直接或間接的影響高血壓[17]。根據(jù)報道[18]：大多數(shù)組織中cGMP-PKG信號通路可調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞收縮和舒張，抗高血壓?？剐募》蚀?，抗動脈粥樣硬化，抗血管損傷/再狹窄。此外，鈣離子信號通路控制新陳代謝、分泌、平滑肌收縮、增殖等多種過程調(diào)節(jié)血壓[19]，提示當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過調(diào)節(jié)平滑肌收縮來發(fā)揮藥效。高血壓合并糖尿病患者腎損害有很大可能性發(fā)生，研究表明：AGE通過RAGE可引起腎臟中NF-κB通路的激活，抑制NF-κB可以降低血壓并且部分減輕心肌肥厚[20]。提示當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號通路對高血壓伴糖尿病并發(fā)癥發(fā)揮治療作用。有研究顯示[21]：HIF-1介導(dǎo)的信號通路可能通過調(diào)節(jié)腎臟髓質(zhì)功能和水鹽電解質(zhì)平衡參與血壓調(diào)節(jié)。

綜上所述，本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對當(dāng)歸揮發(fā)油的成分和作用靶點進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。利用Rstudio軟件R語言編程，從生物過程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)與分子功能(molecular function)三個水平對其進(jìn)行富集分析，同時也進(jìn)行了KEGG富集分析。最后利用分子對接等手段，揭示其通過多組分、多靶點、多通路，從而發(fā)揮整體協(xié)同降壓的藥理機制。