李家妮，韓佳佳，程瑞華，趙唐蓮，張可鋒，饒聰矛，吳 衛(wèi)，高 雅

桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 5410041

免疫性肝損傷是由免疫應(yīng)答介導(dǎo)的，常伴隨炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)破壞[1]。并且，該損傷是肝纖維化、肝硬化乃至肝臟腫瘤等終末病變發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)之路，決定了疾病的轉(zhuǎn)歸與惡化[2]。最近，免疫性肝損傷在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢，臨床上大多采用免疫抑制劑，但治療效果并不明顯，停藥后易復(fù)發(fā)[3]。因此，尋求防治免疫性肝損傷的行之有效的藥物迫在眉睫。老鸛草為牻牛兒苗科老鶴草屬，主產(chǎn)于我國東北、華北等幾個地區(qū)以及某些亞洲國家[4]。老鸛草素(geraniin)主要從老鸛草中分離得到，具有抗氧化、抗炎等多種作用[4,5]。有研究表明，老鸛草素減少了由H2O2誘導(dǎo)的促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，但并未對相關(guān)凋亡通路進行深入研究[6]。此外，Wu等[7]研究表明，老鸛草素和可樂寧聯(lián)合使用能顯著減弱脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞和對乙酰氨基酚(APAP)誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷。目前，我們尚未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)對老鸛草素基于JNK通路對免疫性肝損傷的作用進行報道。因此，本實驗在Wu等[7]和本課題組已證實老鸛草素對D-氨基半乳糖[4]和四氯化碳[5]誘導(dǎo)的肝損傷具有保護作用的基礎(chǔ)上，基于JNK通路進一步研究老鸛草素對LPS導(dǎo)致的免疫性肝損傷小鼠的作用，并探討其作用機制。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

SPF級昆明種小鼠，雄性，共60只，體重18～22 g，4周齡，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，在飼養(yǎng)條件(室內(nèi)溫度：18～22 ℃，相對濕度：50%～60%)下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。許可證號：SCXK(湘)2019-0004。

1.2 實驗藥物與試劑

老鸛草素(上海源葉生物科技有限公司，HPLC≥98%，批號：P11A8F33736)；脂多糖(索萊寶生物科技有限公司)；水飛薊素(美侖生物技術(shù)有限公司，批號：M1120A)；門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)試劑盒(南京建成生物工程公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(南通市碧云天生物技術(shù)研究所)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)；兔抗鼠phospho-ASK1多克隆抗體、兔抗鼠ASK1多克隆抗體(武漢三鷹)、兔抗鼠phospho-MKK4多克隆抗體、兔抗鼠MKK4多克隆抗體、兔抗鼠phospho-JNK多克隆抗體、兔抗鼠JNK多克隆抗體、兔抗phospho-c-Jun多克隆抗體、兔抗鼠c-Jun多克隆抗體(北京奧博森生物技術(shù)有限公司)；β-actin(天錫傲銳東源生物科技有限公司)；辣根酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；蘇木素和伊紅染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Super ECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊基因科技有限公司)。

1.3 儀器

全自動樣品快速研磨儀(上海凈信事業(yè)發(fā)展有限公司)；TGL-16K臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機廠)；切片機(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)；O1ympus BX51顯微鏡(日本奧林巴斯)；Transferpette?移液器(德國普蘭德公司)；Epoch酶標(biāo)儀(美國Bio-tek公司)；純水器(博美生物科技有限公司)；冷凍恒溫振蕩器(常州申光儀器有限公司)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；石蠟包埋機(浙江省金華市科迪儀器有限公司)；Tanon5 200全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析檢測系統(tǒng)(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 造模及給藥

實驗前給予60只SPF級昆明種小鼠自由飲食和活動，7天之后隨機分為正常組、模型組、水飛薊素組(180 mg/kg)和老鸛草素低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg)，每組10只。灌胃給藥每天1次，正常組及模型組小鼠灌胃生理鹽水連續(xù)10天。10天后，參照文獻(xiàn)[8]，模型組和老鸛草素各劑量組小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)，正常組注射等體積的0.9% NaCl溶液。造模后8 h正常飲食，之后的16 h禁食不禁水，造模時間共24 h，之后所有小鼠眼球取血并收集肝組織。血液于離心機中分離血清，取部分肝左葉組織，用4%多聚甲醛溶液固定，剩余肝組織保存于液氮罐中或者-80 ℃冰箱，可保存半年，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。

2.2 實驗小鼠情況觀察

每天觀察記錄小鼠的外觀形態(tài)、活動和進食狀態(tài)、體重改變情況、生存情況和肝組織的外觀形態(tài)。

2.3 肝組織病理學(xué)檢測

取4%多聚甲醛溶液固定的肝組織，嚴(yán)格按照HE染色說明書，進行常規(guī)石蠟包埋，切片后于二甲苯中脫蠟，酒精中脫水，蘇木精和伊紅染料中依次染色，樹脂封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)的改變情況。

2.4 肝損傷指標(biāo)測定

取離心后的血清，生化法測定肝功能因子ALT、AST、ALP、TBIL和氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH-Px、SOD水平；ELISA法檢測組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。兩個測定方法均按照試劑盒的操作步驟加入各反應(yīng)試劑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式計算絕對OD值，分析計算以上因子的活性或含量。

2.5 蛋白表達(dá)情況的測定

用RIPA裂解液從肝組織樣品中提取總蛋白，用BCA試劑盒定量。用10%SDS-PAGE電泳分離含30 μg總蛋白的樣品，于220 mA冰水浴條件下以恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含8%脫脂奶粉的TBST緩沖鹽水封閉β-actin(1∶2 500)、ASK1、p-ASK1、MKK4、p-MKK4、JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun(1∶1 000)蛋白條帶，4 ℃封閉過夜。用TBST洗滌3次(10 min/次)，放入一抗輕搖，4 ℃下孵育過夜。同上TBST洗滌三次后，在4 ℃冰箱于含5%脫脂奶粉TBST稀釋的二抗中孵育1.5 h。同上TBST洗滌三次后，ECL顯色劑按A∶B =1∶1的比例現(xiàn)配現(xiàn)用，注意避光，用Tanon5 200全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯影，以β-actin為內(nèi)參，分析蛋白灰度并計算蛋白相對表達(dá)量。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

3 實驗結(jié)果

3.1 老鸛草素對免疫性肝損傷小鼠狀況的影響

正常組小鼠生長狀態(tài)良好，活動敏捷，皮毛有光澤，進食飲水正常。模型組小鼠造模后昏昏欲睡，全身皮毛蓬松，反應(yīng)遲純，活動減少。水飛薊素組小鼠精神狀態(tài)較好，皮毛光澤度稍有減弱，飲食及活動力較正常組有減弱，但無明顯差異。老鸛草素低劑量組小鼠精神萎靡，進食減少，倦臥少動，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，毛光澤度欠佳。老鸛草素中、高劑量組小鼠精神狀態(tài)較好，皮毛光澤度和水飛薊素組相當(dāng)。

3.2 老鸛草素對免疫性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)的影響

肉眼觀察，正常組小鼠肝臟外觀正常，被膜光滑完整，顏色鮮紅有光澤，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟。模型組小鼠肝臟腫大，顏色輕微發(fā)黃、泛白，表面呈現(xiàn)顆粒斑點狀。與模型組比較，老鸛草素中、高劑量組和水飛薊素組肝臟表面光滑，有光澤，肝損傷均有所減輕，而老鸛草素低劑量組減輕不明顯。

HE染色顯示，顯微鏡下可見正常組(圖1A)小鼠整個肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝臟細(xì)胞基本無病變、壞死和凋亡，肝臟內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組(圖1B)肝小葉結(jié)構(gòu)大部分不完整，破損嚴(yán)重，肝小葉壞死和裂解，并可見大量枯否細(xì)胞增生和炎癥淋巴細(xì)胞的浸潤。水飛薊素組(圖1C)肝組織結(jié)構(gòu)輕度改變，肝細(xì)胞點狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤為輕度。老鸛草素低劑量組(圖1D)肝組織結(jié)構(gòu)改善不明顯，而老鸛草素中劑量組(圖1E)和老鸛草素高劑量組(圖1F)肝組織結(jié)構(gòu)基本存在，肝細(xì)胞輕度固縮、壞死。結(jié)果提示，老鸛草素可改善LPS誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的病理變化，具體結(jié)果見圖1。

圖1 肝組織HE染色病理檢查圖(200×)

3.3 老鸛草素對免疫性肝損傷小鼠血清肝功能因子ALT、AST、ALP和TBIL的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清肝功能因子ALT、AST、ALP和TBIL水平顯著升高，差異均具顯著性(P<0.01)。與模型組比較，老鸛草素中、高劑量組小鼠血清肝功能因子ALT、AST、ALP和TBIL水平均呈現(xiàn)顯著下降趨勢，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。具體結(jié)果見表1。

表1 老鸛草素對血清中肝功能因子ALT、AST、ALP和TBIL的影響

3.4 老鸛草素對免疫性肝損傷小鼠血清中氧化應(yīng)激因子MDA、GSH-Px、SOD水平的影響

采用MDA、GSH-Px與SOD測定試劑盒檢測LPS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷血清氧化應(yīng)激水平的影響，結(jié)果顯示LPS造模后，能夠使LPS誘發(fā)的SPF級昆明種小鼠血清SOD、GSH-Px活力降低，而MDA水平升高(P<0.01)，說明LPS能夠加重小鼠氧化應(yīng)激水平。與模型組相比，老鸛草素中、高劑量組可提高血清中SOD、GSH-Px活力，降低MDA水平(P<0.01或P<0.05)，這些數(shù)據(jù)證實老鸛草素起到降低氧化應(yīng)激的作用，具體結(jié)果見表2。

表2 老鸛草素對血清中氧化應(yīng)激因子MDA、GSH-Px、SOD水平的影響

3.5 老鸛草素對免疫性肝損傷小鼠組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

與正常組相比，模型組小鼠組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，老鸛草素中、高劑量組小鼠組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，顯示其具有抑制肝臟炎癥反應(yīng)的作用。具體結(jié)果見表3。

表3 老鸛草素對肝組織中炎癥因子IL-1β，IL-6及TNF-α表達(dá)水平的影響

3.6 老鸛草素對免疫性肝損傷小鼠肝組織中JNK信號通路中蛋白的表達(dá)的影響

WB實驗結(jié)果顯示：與正常組比較，模型小鼠肝臟內(nèi)p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK以及p-c-Jun/c-Jun的比值明顯上調(diào)，數(shù)據(jù)表明均有顯著性差異(P<0.01)。與模型組相比，老鸛草素中、高劑量組能顯著抑制p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun比值的上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，初步顯示老鸛草素對免疫性肝損傷小鼠肝組織中的JNK信號通路具有調(diào)控作用。具體結(jié)果見圖2。

圖2 老鸛草素對免疫性肝損傷小鼠肝組織中JNK信號通路的影響

4 討論

肝臟富含各種酶，ALT和AST是最常見的兩種，一般地，肝組織中轉(zhuǎn)氨酶的含量是血液的100倍，1%肝細(xì)胞損傷，血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平就增加1倍，這是反饋出肝損傷的最早和最敏感的標(biāo)志之一[9,10]。ALP和TBIL被認(rèn)為是臨床判斷肝損傷的重要指標(biāo)[9]。SOD是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中重要的酶系抗氧化劑，經(jīng)反應(yīng)生成氧氣和過氧化氫而清除體內(nèi)氧自由基，從而抑制后續(xù)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[11]。MDA是過氧化作用的終產(chǎn)物，嚴(yán)重威脅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，使細(xì)胞腫脹、壞死[12]，組織中MDA的含量高低可間接反映肝臟受自由基攻擊時的破壞程度[11]。GSH不僅是體內(nèi)新陳代謝的重要物質(zhì)和最重要的還原性物質(zhì)，還是GSH-Px的底物，能消除氧自由基和超氧陰離子等有毒物質(zhì)，阻止過氧化物入侵細(xì)胞膜[13]。由實驗結(jié)果中可見，本實驗由LPS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL以及MDA水平顯著上升，SOD和GSH-Px活力明顯降低，這與Chou等[8]報道一致。老鸛草素處理后，小鼠血清中肝功能因子ALT、AST、ALP、TBIL以及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平下降，SOD和GSH-Px活力明顯上升。根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們推測老鸛草素防治免疫性肝損傷與抑制轉(zhuǎn)氨酶升高、抗氧化作用有關(guān)。

IL-1β是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵性靶點，雖無法直接對肝臟造成損傷，但是高濃度的IL-1β能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞與免疫細(xì)胞產(chǎn)生一系列細(xì)胞炎癥因子，從而引起炎癥反應(yīng)以及錯誤的免疫應(yīng)答[14]。TNF-α的產(chǎn)生具體機制為肝損傷發(fā)生后，細(xì)胞膜通透性増加，促使Ca2+內(nèi)流，活化庫普弗細(xì)胞，導(dǎo)致TNF-α的大量分泌，加重肝臟的損傷程度[15]。同時，局部組織發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤，TNF-α可誘導(dǎo)IL-6生成，IL-6可作為TNF-α的第二介質(zhì)發(fā)揮作用，導(dǎo)致肝內(nèi)大量細(xì)胞變性壞死，發(fā)生重型肝炎[16]。在本研究中，給予LPS造模后，小鼠肝臟組織中的IL-1β、TNF-α和IL-6水平顯著增高。這些指標(biāo)數(shù)據(jù)的升高趨勢與Dong等[17]相同，與正常組比較均具有顯著性差異。有趣的是，通過老鸛草素的治療可以顯著性逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的這些變化，主要表現(xiàn)為降低組織中IL-1β、TNF-α和IL-6水平，緩解炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果均表明，老鸛草素尚可通過抗炎作用來防治免疫性肝損傷。

JNK是MAPKs通路中的主要成員之一，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過程[18]。在細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)下，JNK主要位于細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)上游信號系列氨基酸殘基磷酸化修飾的級聯(lián)反應(yīng)而激活后，胞漿中的JNK移位到細(xì)胞核使JNK完全活化并具有酶催化活性，參與細(xì)胞調(diào)控[19]。進一步的研究表明，JNK通路被激活后，細(xì)胞出現(xiàn)損傷，最終引發(fā)凋亡[20]。值得注意的是，JNK被抑制后，細(xì)胞損傷和凋亡同樣受到抑制[21]。ASK1位于JNK通路的上游，正常生理狀態(tài)下與相應(yīng)的蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，而處于病理狀態(tài)時，ASK1能通過MAP2K(如MKK4和MKK7)在蘇氨酸183和酪氨酸185的雙重磷酸化激活[22]。尚有實驗證明ASK1過表達(dá)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，而沉默ASK1可抑制細(xì)胞凋亡[23]。c-Jun位于JNK信號通路的下游，活化的JNK可進一步使c-Jun發(fā)生磷酸化，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡等生命進程中發(fā)揮重要作用[24]。此外，臨床上已將c-Jun視為炎癥反應(yīng)、癌癥等多種疾病的研究靶點[25]。在本實驗中，與正常組相比，模型組中p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun的比值均呈現(xiàn)升高趨勢，提示JNK通路被激活；老鸛草素各劑量組組織中p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK以及p-c-Jun/c-Jun的比值較模型組均有不同程度的下調(diào)，證明老鸛草素抑制了JNK的活化及JNK信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，減弱肝細(xì)胞凋亡活動。

綜上所述，老鸛草素能抑制升高的轉(zhuǎn)氨酶、氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)，并可調(diào)控JNK信號通路，減弱凋亡活動，顯示其可明顯改善免疫性肝損傷。