柯欽豪，王世越，王自瑤，周宏福，王 彩，鄭 敏

(湖北科技學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

青磚茶(qingzhuan dark tea)為一種黑茶，是我國(guó)傳統(tǒng)邊銷磚茶之一，已有數(shù)百年生產(chǎn)歷史，湖北省咸寧市為青磚茶的產(chǎn)地之一，咸寧市赤壁在2013年被中國(guó)茶葉流通協(xié)會(huì)正式命名為“中國(guó)青磚茶之鄉(xiāng)”[1]。青磚茶減肥降脂、健脾和胃、安神及止瀉的傳統(tǒng)藥用價(jià)值也已逐漸得到現(xiàn)代藥理學(xué)試驗(yàn)的證實(shí)[2-4]，有研究表明青磚茶還具有新的生物活性，如劉云濤等[5]發(fā)現(xiàn)青磚茶能改善2型糖尿病患者的胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝；青磚茶多糖由青磚茶水提物經(jīng)過高濃度乙醇沉淀而得到，為青磚茶水提物有效成分之一，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶[6]，還具有一定的抗氧化性[7]。具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質(zhì)能夠抑制機(jī)體對(duì)單糖的吸收，穩(wěn)定糖尿病患者的餐后血糖，對(duì)糖尿病患者起到一定的治療作用，這說明青磚茶多糖具有治療糖尿病的藥用價(jià)值。

提取溫度對(duì)青磚茶多糖得率、純度及生物活性均有重要影響。張?jiān)铺靃8]通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定了提取時(shí)間3.3h，料液比1∶16g/mL，提取溫度是95℃時(shí)，青磚茶多糖的得率最高，為11.03%。但沒有不同提取溫度對(duì)青磚茶多糖糖含量及生物活性影響的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以青磚茶為原料，探究提取溫度對(duì)青磚茶多糖組分含量和生物活性的影響。以期找到生物活性最好的青磚茶多糖的提取溫度，為進(jìn)一步開發(fā)和利用青磚茶提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2008年生產(chǎn)的青磚茶，購(gòu)自湖北省趙李橋茶廠有限責(zé)任公司；石油醚(60℃～90℃沸程)、乙醇、聚酰胺(100～200目)、氫氧化鈉、對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷(PNPG)、α-葡萄糖苷酶(50U/mg)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(5-Methyl-2-phenyl-1，2-dihydropyrazol-3-one，PMP)等分析純購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；核糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等色譜純購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

ME204E型精密電子天平，梅特勒公司；TGL-20M型高速低溫離心機(jī)，滬康公司；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸法儀，東京理化器械(株)獨(dú)資工廠；LC-MS-8040型液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC-20ADXR型二元梯度泵、SIL-20AC型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC型柱溫箱、CBM-20A型系統(tǒng)控制器，日本島津公司；ELX800型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖的除雜及提取

青磚茶粉碎過60目篩，80℃干燥至恒重。首先，除去干燥青磚茶里的脂質(zhì)及小分子物質(zhì)[9]，稱量一定質(zhì)量的干燥青磚茶粉末和石油醚溶液，按料液比1∶10g/mL混勻，于60℃冷凝回流3h，然后抽濾，晾干濾渣；再用10倍體積80%乙醇，于80℃冷凝回流2h，以除去多酚、苷類等小分子物質(zhì)，然后抽濾，晾干濾渣，得脫脂除小分子后的青磚茶。

多糖的提取：參照張?jiān)铺靃8]通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定的青磚茶粗多糖提取率最高的提取條件，不同之處為設(shè)置若干個(gè)提取溫度，即分別取脫脂除小分子后的青磚茶，按料液比1∶16g/mL加入蒸餾水，于20℃、40℃、60℃、80℃及100℃熱水冷凝回流提取3.3h，再分別離心(5 000rpm，10min)取上清，50℃真空旋蒸至1/5容積，然后加入無(wú)水乙醇至乙醇濃度為75%，4℃放置8h使多糖沉淀，再離心(5 000rpm，10min)取沉淀。沉淀加水復(fù)溶，再在50℃真空旋蒸以除去乙醇并濃縮多糖溶液，-45℃凍干，得到青磚茶粗多糖，計(jì)算青磚茶粗多糖得率：青磚茶粗多糖得率(%)=[粗多糖質(zhì)量(g)/茶粉質(zhì)量(g)]×100%。

1.2.2 青磚茶多糖的精制[10]

聚酰胺的預(yù)處理：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，10g聚酰胺預(yù)處理后的柱體積(bed volume，BV)約為45mL。稱量一定質(zhì)量的聚酰胺，按比例用4BV 95%的乙醇溶液浸泡聚酰胺8h，然后用超純(ultrapure，UP)水洗至沒有乙醇的味道，用2.5BV 5%NaOH的水溶液浸泡聚酰胺4h，用UP水洗至中性，用2.5BV 10%HCl的水溶液浸泡聚酰胺4h，再用UP水洗至中性，濕法上柱，得5個(gè)直徑為26mm、高度為85mm的聚酰胺層析柱，每個(gè)層析柱用UP水以4.5mL/min平衡135mL。

青磚茶多糖的精制：用不同溫度提取得到的青磚茶粗多糖配制10mg/mL的水溶液，超聲5min促進(jìn)多糖充分溶解，然后離心除去不溶物。分別取各多糖溶液20mL(即使用青磚茶粗多糖的質(zhì)量為0.2g)，上樣到各個(gè)層析柱上，每個(gè)層析柱用225mL的UP水以4.5mL/min的速度洗脫，收集洗脫液，50℃真空旋蒸至約10mL容積，再-45℃凍干，得到青磚茶精制多糖TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80及TPS-100，計(jì)算精制多糖得率：青磚茶精制多糖得率(%)=青磚茶粗多糖得率(%)×[精制多糖質(zhì)量(g)/青磚茶粗多糖質(zhì)量(g)]×100%。

1.2.3 精制多糖糖含量的分析

多糖含量的分析依照國(guó)標(biāo)SN/T 4260-2015號(hào)粗多糖的測(cè)定方法，即苯酚濃硫酸法，離心管里加入0.2mL濃度依次為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL葡萄糖的水溶液與0.2mL 5%苯酚的水溶液，混勻后加入1mL濃硫酸，避光靜置10min，再30℃水浴20min，以0.2mL UP水加0.2mL 5%苯酚的水溶液再加入1mL濃硫酸為校零組在490nm處檢驗(yàn)吸光度，再做吸光度-葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別配制0.5mg/mL五種多糖的水溶液，用制作吸光度-葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法檢測(cè)五種多糖水溶液的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出的糖濃度再除以0.5mg/mL即為糖含量。每種多糖3次配液，求3次糖含量。

1.2.4 多糖的單糖種類測(cè)定

多糖的水解：以2mol/L的HCl作為溶劑，分別配制1mg/mL的五種多糖溶液，各取1mL，90℃水浴3h使多糖水解，冷卻至室溫，離心(8 000rpm，10min)取上清，得水解液。

多糖的衍生：取各水解液0.5mL，分別加入0.5mL氨水及0.5mol/L PMP的甲醇溶液，渦旋3min，70℃避光水浴30min，再冷卻至室溫，均加入10%的冰乙酸調(diào)至pH為7。分別加入1mL氯仿，渦旋3min，離心(8 000rpm，10min)去除下層氯仿，重復(fù)加氯仿，離心，去氯仿3次。取水層，得到5種PMP衍生多糖。

內(nèi)標(biāo)及混標(biāo)的衍生：稱取10mg內(nèi)參單糖葡萄糖醛酸，蒸餾水定容至10mL，即得1mg/mL內(nèi)參單糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，又稱內(nèi)標(biāo)。精密稱取9種標(biāo)準(zhǔn)單糖(核糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸)各10mg，混勻，蒸餾水定容至10mL，即得1mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)單糖儲(chǔ)備液，又稱混標(biāo)。取內(nèi)標(biāo)及混標(biāo)各0.5mL按多糖的衍生方法進(jìn)行操作，得到PMP衍生內(nèi)標(biāo)及混標(biāo)。

衍生多糖及衍生混標(biāo)上樣前準(zhǔn)備：分別取五種衍生多糖及衍生混標(biāo)各0.5mL，分別加入0.1mL衍生內(nèi)標(biāo)，再分別用0.22μm的濾膜過濾，得到單糖檢測(cè)樣品TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80、TPS-100及混標(biāo)溶液。

5種多糖的單糖檢測(cè)，具體條件如下：色譜柱：shim-pack VP-ODS228-34937-92(5.0μm，250mm×4.6mm i.d.)；流動(dòng)相A：83%-乙酸銨(5mmol/L)，流動(dòng)相B：17%-乙腈；流速：0.9mL/min；柱溫：27℃；進(jìn)樣體積：5μL；電噴霧離子源進(jìn)行正離子模式檢測(cè)(質(zhì)電荷比m/z為100-600，電噴霧電壓為3.5KV，高純氮?dú)鉃榕鲎矚怏w，碰撞氣壓力：230KPa；霧化氣流速：3.0L/min；干燥器流量：15.0L/min)；分別取單糖檢測(cè)樣品TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80、TPS-100及混標(biāo)溶液，進(jìn)行液質(zhì)分析。記錄出峰時(shí)間，與混標(biāo)比較各多糖含有的單糖種類。

1.2.5 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

1.2.6 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)[12]

1.2.7 抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)[13]

配制溶液：磷酸鹽緩沖液(pH 6.8):取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250mL，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118mL，用純水稀釋至1 000mL；α-葡萄糖苷酶溶液:稱取適量α-葡萄糖苷酶粉末，用磷酸鹽緩沖液溶解定容，配成0.5U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液；PNPG溶液:精密稱取188.31mg PNPG，先加1mL DMSO溶解，再加磷酸鹽緩沖液定容至25mL，配制成25mmol/L的母液，用磷酸鹽緩沖液稀釋至10mmol/L。碳酸鈉溶液:準(zhǔn)確稱取5.30g碳酸鈉，加250mL蒸餾水溶解，配制成0.2mol/L碳酸鈉溶液。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 精制多糖的得率

粗多糖及精制多糖的宏觀形貌分別見圖1、圖2(封二)。5種粗多糖的得率分別為(4.34±0.06)%、(5.65±0.08)%、(6.63±0.09)%、(6.65±0.07)%、(7.26±0.09)%(n=3，F(xiàn)=624.5，P<0.05)，說明粗多糖的得率隨著提取溫度的升高而升高，可能與溫度升高后破壞細(xì)胞壁更徹底，及溶出成分內(nèi)能增加，熱運(yùn)動(dòng)更加劇烈，溶出增多有關(guān)。5種精制多糖TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80及TPS-100的得率分別為(2.02±0.02)%、(2.94±0.05)%、(3.18±0.07)%、(3.03±0.09)%及(2.11±0.06)%(n=3，F(xiàn)=237.6，P<0.05)，60℃以后，隨著提取溫度的升高，粗多糖的得率繼續(xù)增加，但精制多糖的得率卻在降低，說明隨著溫度的繼續(xù)升高，提取出來(lái)更多的是雜質(zhì)，雜質(zhì)通過后期的聚酰胺層析柱被除去，而且溫度的進(jìn)一步升高，可能會(huì)破壞原先已經(jīng)溶出的多糖成分，所以60℃為提取本實(shí)驗(yàn)精制多糖的最佳溫度。

2.2 精制多糖的糖含量

5種精制多糖TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80及TPS-100的糖含量依次為(36.87±2.39)%、(44.71±2.91)%、(52.76±4.24)%、(52.33±4.01)%及(35.93±1.73)%(n=3，F(xiàn)=12.74，P<0.05)，通過F檢驗(yàn)可知TPS-20及TPS-100分別與TPS-60相比較具有顯著性差異，在α=0.05的前提下認(rèn)為，TPS-60的糖含量大于TPS-20及TPS-100。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，60 ℃為提取本實(shí)驗(yàn)精制多糖的最佳溫度，此時(shí)精制多糖的得率最高，精制多糖的糖含量也較高。

2.3 多糖的單糖分析

混標(biāo)(a)及5種多糖(b-f)中單糖的HPLC-MS分析見圖3(封二)。根據(jù)5種多糖質(zhì)荷比和出峰時(shí)間，可以確定五種多糖TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80及TPS-100均含有核糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸。

2.4 多糖的DPPH自由基清除活性

五種多糖TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80及TPS-100的DPPH自由基清除活性見表1，從中可知，每一種多糖均具有DPPH自由基清除活性，當(dāng)多糖濃度為0.6、0.8及1.0 mg/mL時(shí)，TPS-40、TPS-60、TPS-80之間的DPPH自由基清除活性沒有顯著性差異，但TPS-40、TPS-60、TPS-80分別與TPS-100比較具有顯著性差異，且TPS-20在不同濃度時(shí)，分別與TPS-40、TPS-60、TPS-80比較也有顯著性差異，即TPS-40、TPS-60、TPS-80的DPPH自由基清楚活性優(yōu)于TPS-20和TPS-100，可能在40 ℃以前，隨著溫度的升高，具有自由基清除活性的多糖的溶出增加，當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，具有自由基清除活性的多糖被高溫改變了結(jié)構(gòu)，失去部分自由基清除活性，還有可能與80℃過后，多糖的糖含量降低有關(guān)。

表1 不同提取溫度多糖的DPPH自由基清除活性

2.5 多糖的羥自由基清除活性

五種多糖TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80及TPS-100的羥自由基清除活性見圖4(封二)。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，各種多糖均有羥自由基清除活性，但統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示，相同濃度不同多糖的羥自由基清除率均無(wú)顯著性差異，提示提取溫度并未對(duì)青磚茶多糖的羥自由基清除活性產(chǎn)生影響。

從以上兩個(gè)檢驗(yàn)青磚茶多糖抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)可知，不同提取溫度的青磚茶多糖均具有抗氧化活性，且TPS-40、TPS-60、TPS-80的DPPH自由基清除活性優(yōu)于TPS-20、TPS-100。

2.6 多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性

五種多糖TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80及TPS-100的α-葡萄糖苷酶抑制活性見圖5(封二)。不同提取溫度多糖均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示僅多糖濃度為0.6 mg/mL時(shí)，TPS-60的α-葡萄糖苷酶抑制活性強(qiáng)于TPS-40，可以認(rèn)為提取溫度并未對(duì)青磚茶多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性產(chǎn)生影響。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以青磚茶為原料，料液比等其他提取條件不變的前提下，采取不同提取溫度，經(jīng)提取純化得到了5種青磚茶多糖TPS-20、TPS-40、TPS-60、TPS-80及TPS-100，通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其糖含量、單糖種類、抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性，發(fā)現(xiàn)他們均含有核糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸，說明此實(shí)驗(yàn)中溫度對(duì)青磚茶多糖中單糖的種類不會(huì)產(chǎn)生影響，不會(huì)改變多糖中單糖的組成，只會(huì)改變多糖的溶出率。其中TPS-60的得率及糖含量較其他多糖高，且不同提取溫度青磚茶多糖均具有抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性，40到80℃之間提取得到的青磚茶多糖的抗氧化活性更優(yōu)。

總而言之，本實(shí)驗(yàn)得出了近似白色的精制青磚茶多糖的提取及純化方案， 確定了青磚茶多糖其中單糖的種類，且在一定溫度范圍內(nèi)，單糖種類與提取溫度無(wú)關(guān)，證實(shí)了青磚茶多糖具有抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性，并且60 ℃提取得到的青磚茶多糖TPS-60提取率、糖含量均較高，具有自由基清除活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性，因此，青磚茶多糖可以作為天然抗氧化劑及治療糖尿病的藥物加以研發(fā)利用。