黃賁亨，黃 彬

(湖北科技學院五官醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100)

與成熟恒牙不同，當年輕恒牙因齲壞、外傷等原因?qū)е卵浪韪腥具M而出現(xiàn)牙髓壞死時，較薄的根管壁和未閉合的根尖孔使治療過程充滿困難[1]。盡管目前主要治療方法有根尖誘導成形術和根尖屏障術，但存在一些不足之處：一方面缺乏組織修復能力，無法促進根管內(nèi)受損牙髓組織的再生；另一方面因牙根發(fā)育停滯而出現(xiàn)根管壁較薄和短根的情況，增加牙折的發(fā)生率，最終導致治療失敗[2]。再生性牙髓治療(regenerative endodontic treatment，RET)是以組織工程學為基礎，通過再生的牙髓樣組織取代感染或壞死的牙髓組織，從而最大程度保留牙齒的活力使其繼續(xù)發(fā)育[3]。越來越多的臨床研究[4-6]證明了RET應用于牙髓壞死的年輕恒牙的優(yōu)異性。牙髓再生與組織工程學中的3個主要組分密切相關：干細胞、支架及生長因子。濃縮生長因子(concentrated growth factors，CGF)作為最新一代的生物支架材料，其制備過程不需要添加其他試劑，是一個更簡單的過程。CGF中產(chǎn)生的纖維蛋白網(wǎng)絡與天然纖維蛋白網(wǎng)絡非常相似，并且包含血小板和白細胞所產(chǎn)生的各種生長因子，是一種與生長因子良好結(jié)合的支架基質(zhì)。此外，近年來大量研究[7-8]證明其擁有巨大的組織細胞再生潛力，對于細胞的增殖、分化和遷移均發(fā)揮良好效果。本文主要對CGF的主要成分、功能及其應用于再生性牙髓治療的作用做一綜述。

1 CGF的主要成分及功能

經(jīng)過特定的變速離心程序后，血液樣本呈現(xiàn)3層結(jié)構(gòu)，CGF位于中間層。超微結(jié)構(gòu)顯示，CGF由大量細纖維蛋白和細纖維蛋白原構(gòu)成，并呈現(xiàn)出多孔結(jié)構(gòu)[9]。經(jīng)組織染色觀察，CGF上部沒有細胞，而在下部聚集大量的白細胞、紅細胞以及血小板，嵌入在三維纖維網(wǎng)絡中[10]。另外CGF中存在大量CD34+細胞，其在血管生成和維持血管形態(tài)中的作用得到越來越多研究證據(jù)的支持[11-12]。生長因子是一類天然生物介質(zhì)，可調(diào)節(jié)組織修復中重要的細胞活動，包括細胞增殖、分化、遷移和胞外基質(zhì)合成。CGF內(nèi)的血小板被活化后脫顆?？蓪е麓罅可L因子釋放，其中主要有5種代表性生長因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor-bb，PDGF-BB)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和類胰島素生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)[10]。TGF-β1是一種對牙齒組織具有多種作用的復雜分子，可以在體外通過成牙本質(zhì)細胞和成牙本質(zhì)樣的分化來誘導牙本質(zhì)基質(zhì)的上調(diào)；此外，TGF-β1能夠在體內(nèi)誘導牙髓干細胞介導的礦化和牙本質(zhì)小管內(nèi)礦化[13]。PDGF-BB和VEGF在組織再生過程中對血管生成起重要作用，研究表明[14]，PDGF-BB可以增加VEGF在成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞中的表達，在PDGF-BB基因轉(zhuǎn)染人牙髓干細胞(human dental stem cells，hDPSCs)后VEGF中mRNA的表達和蛋白質(zhì)水平增加，hDPSCs分泌的PDGF-BB和VEGF可以增加血管生成的潛力。相關研究[15]表明，bFGF可以誘導牙周韌帶成纖維細胞成骨分化，相反，抗bFGF抗體顯著抑制CGF中骨鈣蛋白、骨橋蛋白、osterix的表達。IGF-1對成骨細胞具有呈劑量依賴性的趨化作用[16]，已有研究[17]顯示IGF-1參與骨折修復過程中成骨細胞的分化，并在協(xié)調(diào)軟骨細胞、破骨細胞方面起重要作用。

2 CGF在牙髓再生中的作用

促進細胞增殖是牙髓再生的先決條件，CGF可明顯提高細胞有絲分裂的潛力，促進牙髓內(nèi)細胞的增殖，但不同濃度CGF之間的作用效果尚存在不一致性。Jin等[18]將hDPSCs用不同濃度的CGF提取物處理3d，通過熒光標記觀察發(fā)現(xiàn)在高劑量(50%和80%)的CGF組中檢測到更多hDPSCs的增殖，并且呈劑量依賴性。Jun等[8]研究發(fā)現(xiàn)，低于10%的CGF對人牙髓細胞(dental pulp cells，DPCs)具有加快生長作用，呈劑量依賴性，將濃度提高到15%后與10%濃度的CGF作用效果相同，無統(tǒng)計學差異。有其他學者[19-20]研究發(fā)現(xiàn)也得到相似的結(jié)論，1%～10%的CGF提取物對干細增殖呈劑量依賴性，而20%的CGF則具有抑制作用。盡管CGF對細胞增殖的影響有劑量依賴性，但隨著CGF濃度的增加并不總是促進細胞增殖，類似結(jié)論在Qin等[21]研究CGF對施萬細胞的增殖作用時也得到驗證，認為可能是早期細胞較少時過量的生長因子對細胞增殖有一定抑制作用。以上對于不同濃度CGF對細胞增殖作用的研究均得到了不錯的結(jié)果，提示CGF在促進細胞增殖上具有巨大潛力，盡管確切的機制尚不清楚，但低濃度CGF與其緩慢釋放生長因子的特征相結(jié)合能產(chǎn)生最佳效果，這有利于CGF在體內(nèi)作為支架的應用。

加速細胞遷移組織損傷再生修復的過程需要募集周邊干細胞至受損區(qū)域或誘導受損區(qū)域干細胞定向分化，從而完成組織修復。RET的理論依據(jù)是在組織工程學基礎上將干細胞募集至根管內(nèi)定植，并在CGF所釋放的生長因子作用下，通過調(diào)節(jié)細胞歸巢誘導牙髓干細胞粘附在損傷部位，以替代原本的成牙本質(zhì)細胞。Hong 等[10]將hDPSCs通過血清饑餓法培養(yǎng)后，分別加入濃度為10%、20%、50%、80%的CGF培養(yǎng)基中，通過體外傷口愈合試驗評估CGF對hDPSCs的趨化活性，結(jié)果表明低濃度(10%和20%)CGF顯著刺激細胞遷移，但是隨著濃度增加，CGF的作用明顯減弱甚至表現(xiàn)無作用，認為有可能高水平的白細胞、IL-1β和IL-6與高劑量CGF的負作用相關。Xu[22]等研究CGF對LPS刺激條件下hDPSCs遷移能力的影響發(fā)現(xiàn)，LPS組的遷移細胞數(shù)量比單純CGF組的遷移細胞更多，且在LPS刺激作用的第一周內(nèi)，CGF減弱IL-8的表達，表明CGF在LPS刺激下仍可以促進hDPSCs遷移，且對受炎癥刺激的牙髓細胞具有抑制作用，提示CGF有助于感染根管內(nèi)牙髓的修復和再生。

誘導成骨分化堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性可以決定CGF誘導成骨細胞分化的效果，其表達是成骨細胞分化的明顯標志[23]。Chen 等[24]研究牙CGF對牙齦源性間充質(zhì)干細胞(gingiva-derived mesenchymal stem cells，GMSCs)作用時，通過分析ALP的酶活性，發(fā)現(xiàn)CGF的ALP活性最高，提示CGF可以誘導GMSCs的成分化，進一步通過在第7、14、24d進行茜素紅染色，在21d礦化結(jié)節(jié)最普遍，成骨誘導明顯，通過比較分析，證明在加入CGF實驗組中的礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)較早，有更高的密度。另一方面，CGF上調(diào)牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix acidic phosphoprotein 1，DMP1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)和矮小相關轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)的mRNA表達，可能CGF通過調(diào)節(jié)dSPP、dMP1、BMP2和RUNX2的表達來促進GMSCs細胞的成骨細胞分化，蛋白印跡法結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，支持CGF上調(diào)DSPP、DMP1、BMP2、RUNX2促進干細胞成骨分化的假說。有其他學者[9]研究證明CGF通過不同信號通路蛋白加速礦化，促進礦化結(jié)節(jié)形成。Hong等[25]觀察CGF對根尖乳頭干細胞(stem cells of apical papilla，SCAPs)的作用時，發(fā)現(xiàn)ALP、DMP-1、 DSP、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)的表達在前7d受抑制，在14d后相關基因表達上調(diào)，該結(jié)果與之前相關研究結(jié)果并不一致，可能的原因是不同實驗使用的是不同細胞以及CGF中含有部分炎癥因子抑制SCAPs的分化。值得一提的是，有研究[26]表明凍干制劑的CGF在早期較緩釋制劑的CGF在成骨上有更優(yōu)異的表現(xiàn)，在后期緩釋制劑的CGF在成骨礦化作用上有更顯著優(yōu)勢，提示可能不同制劑的CGF在成骨作用上也存在差異。

增加血管生成在生理或病理情況下，VEGF能刺激血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，是介導血管生成最有效的生長因子，它的調(diào)節(jié)對于牙髓再生中新生血管的形成至關重要，被認為是淋巴管，血管生成的主要信號蛋白[27-28]。Jun等[8]研究CGF對人牙髓細胞血管生成作用時，用濃度為2%、5%、10%的CGF分別處理DPCs，在培養(yǎng)0、12、24、36h后經(jīng)RT-qPCR測定，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)PDGF、趨化因子受體4(chemokine receptor type 4，CXCR4)和VEGF的mRNA表達均顯著升高，該表達呈劑量依賴性；同時觀察發(fā)現(xiàn)VEGF和CXCR4的表達也呈現(xiàn)一致的結(jié)果，在培養(yǎng)4h后細胞開始形成管狀結(jié)構(gòu)，CGF組管狀結(jié)構(gòu)形成數(shù)量顯著增加，并呈劑量依賴性。另外，Xu 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，將CGF填充至根管內(nèi)不僅能促進牙髓樣組織再生，并且其具有類似天然組織的血管結(jié)構(gòu)，為牙髓血運的重建提供結(jié)構(gòu)基礎。

3 總結(jié)與展望

總的來說，CGF不僅在制備上擁有快速、簡單、方便的特點，含有豐富的生長因子使其可以募集根尖周圍區(qū)域的干細胞，誘導如hDPSCs等干細胞增殖、遷移和分化，形成再生的牙髓樣組織，并具有血管樣結(jié)構(gòu)。已有研究[29]表明，用更低的離心速度和更短的時間可能有利于增加PRF釋放生長因子，增加成纖維細胞增殖遷移，其結(jié)果直接影響組織再生，CGF以較低的離心速度和時間制備也有望成為未來的趨勢。目前為止，CGF作用于組織細胞時所釋放的多種生長因子相互之間協(xié)同的機制還未闡明，臨床治療的預后評估研究數(shù)據(jù)較少。因此，相關體內(nèi)外研究和臨床實驗的開展將有助于進一步探索CGF在牙髓再生中與不同組織細胞的相互作用機制，為其臨床應用提供更為廣闊的前景。