劉思婷，單鳴秋，郭書臣

天麻為我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有治療頭暈、頭痛、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、降血壓等藥理作用。天麻中含量較高的成分是天麻素，現(xiàn)代藥理研究證明藥理作用與天麻相似，被認(rèn)為是天麻的主要活性成分。但是仍有較多文獻(xiàn)指出天麻中所含香莢蘭醇及巴利森苷類成分也具有較強(qiáng)的生理活性，尤其是巴利森苷類在天麻中含量超過了天麻素與對(duì)羥基苯甲醇的含量。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定搜集于不同產(chǎn)地、不同藥店的市售天麻飲片中天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C6種活性成分的含量。

有較多研究表明，天麻還具有顯著的抗氧化活性作用。近年來，人們對(duì)抗氧化食品和藥物日漸熱衷，天麻作為一味天然純植物藥物，抗氧化性顯著，毒副作用較少，在抗氧化方面具有極佳的研究和開發(fā)價(jià)值。體外評(píng)價(jià)抗氧化活性的方法包括化學(xué)方法和生物學(xué)方法，主要表現(xiàn)在清除自由基、抑制脂質(zhì)的氧化降解、抑制促氧化劑和還原能力幾個(gè)方面。其中清除1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）自由基方法快速、簡(jiǎn)便，是目前應(yīng)用最廣泛的一種植物提取物體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法。本研究自2019年1—6月以HPLC-DPPH法評(píng)價(jià)天麻的抗氧化活性。結(jié)合天麻6種活性成分含量與抗氧化活性測(cè)定結(jié)果，探討天麻活性成分與天麻抗氧化活性之間的相關(guān)性，以期為天麻抗氧化方面的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

Shimadzu Librorael-40SM型電子分析天平，精確至0.01 mg；WATERSALLIANCE-2695 HPLC系統(tǒng)（配PDA檢測(cè)器，美國WATERS公司）；KQ-500B超聲清洗儀；Anke TGL-16B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。天麻素、香莢蘭醇對(duì)照品，均購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)分別為00256-2013、01083-2013，對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷C、巴利森苷B、巴利森苷A、對(duì)照品，均購自南京森貝伽生物有限公 司，批 號(hào) 分 別 為2014-0192、2014-0080、2014-0079、2014-0078，所有對(duì)照品純度均≥98%。DPPH（純度＞97.0%，梯希愛上?；晒I(yè)）；水為純凈水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。共收集29批不同產(chǎn)地天麻飲片，購自江蘇省內(nèi)各大藥店，均經(jīng)鑒定為蘭科天麻屬植物天麻Gastrdia elata B1.的干燥塊莖切片。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 天麻對(duì)照品的制備 取各對(duì)照品加甲醇-水（3∶97）混合溶液制成混合對(duì)照品溶液：含天麻素60.30μg/mL、對(duì)羥基苯甲醇92.30μg/mL、香莢蘭醇3.02μg/mL、巴利森苷A310.86μg/mL、巴利森苷B95.54μg/mL、巴利森苷C445.72μg/mL。色譜圖見圖1。

2.1.2 天麻供試品的制備 取本品粉末（過三號(hào)篩）2 g，精密稱定，放入錐形瓶中，加入稀乙醇50 mL，振搖2 h，精密稱定質(zhì)量，加熱回流3 h后放置至冷卻，再次精密稱定質(zhì)量，以稀乙醇補(bǔ)足缺失質(zhì)量，振搖，濾過，取濾液10 mL，濃縮至近干，加甲醇-水（3∶97）溶液溶解殘?jiān)?，移?5 mL容量瓶中，并用甲醇-水（3∶97）溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A為對(duì)照品溶液；B為供試品溶液

2.1.3 DPPH溶液配置 精密稱取16.32 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶液，振搖至溶解，制成濃度為100μg/mL的DPPH溶液，錫箔紙密封放入冰箱-20℃儲(chǔ)存。色譜圖見圖2A。

2.1.4 DPPH清除率實(shí)驗(yàn)供試品溶液配置 精密稱取天麻樣品粉末（過三號(hào)篩）各0.2 g置于錐形瓶中，精密加入40%甲醇水溶液4 mL，搖勻，塞住瓶口，超聲（功率120 W，頻率40 kHZ）45 min，取出，以40%甲醇水溶液補(bǔ)足缺失重量，放入高速離心機(jī)，4 000 r/min離心10 min，取上清液，再在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL按照“2.1.3”項(xiàng)下配置的DPPH溶液0.5 mL避光反應(yīng)60 min，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。色譜圖見圖2B。

2.2 色譜條件

2.2.1 活性成分含量測(cè)定 色譜條件Hypersil C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相為0.5%醋酸水溶液-0.5%醋酸甲醇溶液；體積流量：0.8 mL/min；檢測(cè)波長270 nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.2.2 DPPH清除率實(shí)驗(yàn) 色譜條件Hedera ODS-2色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：0.2%甲酸水溶液-0.2%甲酸甲醇溶液；體積流量：1 mL/min；檢測(cè)波長：520 nm；進(jìn)樣量：10μL。

圖2 高效液相色譜圖：A為DPPH溶液；B為供試品溶液

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 精密量取5 mL混合對(duì)照品溶液，移至10 mL容量瓶中，加水至刻度。加入甲醇-水（3：97）混合溶液，以倍比稀釋法制成系列對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)三針，分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/mL）與峰面積平均值（y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1，數(shù)據(jù)顯示6種活性成分線性關(guān)系均較好，均r≧0.999 3。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為S9的天麻樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，進(jìn)樣量20μL，記錄各峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果見表2，均RSD＜3%，表明精密度良好。

表1 天麻6種成分的回歸方程

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為S9的天麻樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、1、2、4、6、9、12、18 h各進(jìn)樣一次，共計(jì)8次，每次20μL，記錄各峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果見表3，均RSD＜3%，表明供試品溶液中6種成分在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 DPPH清除率實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間考察 精密稱取樣品0.2 g，按照“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，加入100μg/mL DPPH溶液0.5 mL，分別反應(yīng)30～120 min（間隔均為10 min），結(jié)果見圖3。如圖所示，樣品DPPH自由基清除率為24.96%～48.32%，其中反應(yīng)達(dá)到60 min時(shí)，天麻對(duì)DPPH清除率達(dá)到最大值，60 min以后逐漸下降并趨于平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)選擇60 min為樣品與DPPH的反應(yīng)時(shí)間。

2.3.5 DPPH清除率實(shí)驗(yàn)反應(yīng)濃度考察 精密量取DPPH溶液，加甲醇分別制成濃度為400、350、300、250、200、150、100、50μg/mL的DPPH對(duì)照品溶液。

表2 天麻6種成分的精密度

表3 天麻6種成分的穩(wěn)定性

圖3 天麻30～120 min內(nèi)DPPH自由基反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

精密稱取樣品0.2 g，共7份，按照“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別加入上述不同濃度的DPPH對(duì)照溶液0.5 mL，反應(yīng)60 min，結(jié)果見圖4。圖示隨著DPPH溶液濃度增大，DPPH自由基清除率不斷下降，其中濃度為400μg/mL時(shí)清除率達(dá)到最小，小于10%，濃度為100μg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值，接近60%，因而本文選取DPPH濃度100μg/mL作為反應(yīng)濃度。

圖4 不同濃度的DPPH自由基清除率

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 6種活性成分含量測(cè)定 取29批天麻樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，用外標(biāo)法計(jì)算其中的天麻素、香莢蘭醛、香莢蘭醇、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷B、巴利森苷A、巴利森苷C的含量，其結(jié)果見表4。

3.2 DPPH清除率 取29批天麻樣品，按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件按下進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)各峰面積，并根據(jù)下列公式計(jì)算清除率。結(jié)果見表5。

清除率=｛（A-Ai ） /A｝×100%。其中，A 為DPPH溶液0.5 mL+40%甲醇溶液0.5 mL的峰面積；Ai為各樣品所制成的供試品溶液的峰面積。

4 討論

天麻飲片6種活性成分的含量結(jié)果顯示天麻飲片中巴利森苷類成分含量最高，按照其含量高低排序?yàn)榘屠誂＞巴利森苷B＞巴利森苷C；天麻素含量次之；對(duì)羥基苯甲醇與香莢蘭醇的含量最低。同時(shí)，除少數(shù)幾批外，大部分飲片中天麻素含量越高，巴利森苷類成分的含量也越高。而從化學(xué)結(jié)構(gòu)看，巴利森苷B、A、C均為檸檬酸與天麻素結(jié)合而成的酯類。由此說明，巴利森苷類成分可能與天麻素存某種相互轉(zhuǎn)化或相互依存的內(nèi)在聯(lián)系。

表4 29批天麻飲片中6種成分的百分含量/%

表5 29批天麻樣品的DPPH自由基清除率

DPPH清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天麻飲片反應(yīng)1h后的DPPH自由基清除率達(dá)到41.94%～93.91%，說明天麻具有很強(qiáng)的抗氧化活性。其中，樣品S1～S4清除率為41.94%～54.94%，樣品S5～S29清除率為64.35%～93.91%，最高清除率高于最低清除率的兩倍。說明不同產(chǎn)地不同批次天麻飲片的抗氧化活性存在差異。

結(jié)合29批樣品6種活性成分的含量測(cè)定的結(jié)果與天麻飲片DPPH自由基清除率結(jié)果分析：（1）天麻素過去一直被認(rèn)為是天麻的主要活性成分，利用EXCEL對(duì)天麻素含量與DPPH自由基清除率結(jié)果進(jìn)行線性擬合，結(jié)果?=6.396 9x+76.999，r=0.068＜0.1，說明天麻素含量與天麻抗氧化活性無明顯相關(guān)性；（2）利用EXCEL分別對(duì)對(duì)羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量與DPPH自由基清除率結(jié)果進(jìn)行線性擬合，結(jié)果相關(guān)系數(shù)r分別為0.148、0.155、0.122、0.023、0.073。說明對(duì)羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量與天麻抗氧化活性極弱正相關(guān)或無明顯相關(guān)性。（3）有研究表明，植物中的抗氧化活性可能與其總酚含量有關(guān)，總酚含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)。本研究中6種活性成分均為酚性成分，同時(shí)也是天麻中含量較高的酚性成分，并且巴利森苷類成分可能與天麻素存在某種相互轉(zhuǎn)化或相互依存的內(nèi)在聯(lián)系。因此研究6種活性成分與天麻抗氧化活性的相關(guān)性存在意義。利用EXCEL對(duì)6種活性成分含量總和與天麻飲片DPPH自由基清除率進(jìn)行線性擬合，結(jié)果?=1.213 6x+82.472，r=0.050＜0.1，說明6種活性成分的含量總和與天麻飲片DPPH自由基清除率也無明顯相關(guān)性。

綜上所述，天麻任意一種活性成分或6種活性成分的總量與DPPH自由基清除率均無明顯關(guān)聯(lián)性，可能存在其他有效清除自由基的成分?；蛘?，雖然所測(cè)的6種活性成分均為天麻酚性成分，但中藥材中的各種成分往往具有協(xié)同作用，抗氧化活性可能是由于多種活性成分的協(xié)同作用，而并不僅僅是單個(gè)成分或幾個(gè)成分作用的簡(jiǎn)單疊加。