廖梅

藥用紫草是紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc（LE，俗稱(chēng)硬紫草）、新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst（AE）和內(nèi)蒙古紫草Arnebia guttata Bunge（AG）的干燥根，收載于《中國(guó)藥典》，性味甘、咸寒，有涼血活血，解毒透疹之功效，用于治療血熱毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，瘡瘍，濕疹，水火燙傷等癥。作為藥用紫草的主要有效成分，紫草素類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等顯著藥理活性，還可作為天然色素應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景巨大。紫草按產(chǎn)地分為國(guó)產(chǎn)，進(jìn)口，按質(zhì)地分為軟苗，硬苗。國(guó)產(chǎn)紫草的產(chǎn)地主要為新疆，偶見(jiàn)內(nèi)蒙古，東北產(chǎn)地。近年來(lái)，隨著新疆紫草資源的減少，紫草商品主要以巴基斯坦等地進(jìn)口為主，因受自然環(huán)境和種植采收標(biāo)準(zhǔn)等因素的影響，不同產(chǎn)地的紫草質(zhì)量參差不齊，無(wú)論在形態(tài)學(xué)還是化學(xué)成分上均表現(xiàn)出顯著差異，給臨床安全有效用藥帶來(lái)挑戰(zhàn)，如何選用成為關(guān)鍵。中藥化學(xué)成分比較復(fù)雜，在鑒別上有一定難度，采用單一指標(biāo)進(jìn)行含量控制并不能從整體上反映紫草飲片的質(zhì)量全貌?；赨HPLC-QTRAP-MRM技術(shù)的特征輪廓譜是在LC-MS/MS技術(shù)基礎(chǔ)上建立的能全面、特異性識(shí)別和表征一些結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān)成分的特殊指紋圖譜，能同時(shí)進(jìn)行定性與定量分析，近年來(lái)已逐漸成為天然藥物質(zhì)量控制的有效手段。因此，本文擬通過(guò)UHPLC-QTRAP-MRM技術(shù)建立紫草的特征輪廓譜，并對(duì)22批不同來(lái)源紫草進(jìn)行主成分分析（PCA）、主成分判別分析（PCA-DA）和T檢驗(yàn)分析，以期對(duì)市售不同來(lái)源藥用紫草藥材的整體質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為該藥材的產(chǎn)地選擇及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器 島津LC20ADXR高效液相色譜儀聯(lián)合AB SCIEX QTRAP4000質(zhì)譜儀（配備MarkerView1.2.1軟件）；Mettler Toledo MS103DU電子分析天平。1.2 試藥 月旭Ultimate UHPLC XB-Ccolumn（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；雙氯芬酸鉀（批號(hào)B25405，源葉生物）；色譜純甲醇、乙腈（美國(guó)Fisher公司）；分析純98%甲酸和甲酸銨（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

藥用紫草飲片來(lái)自安徽省亳州市藥材市場(chǎng)，由嘉應(yīng)學(xué)院張聲源副教授鑒定（表1）。

表1 藥用紫草樣品列表

2 方法與結(jié)果

2.1藥用紫草UHPLC-QTRAP-MRM特征輪廓譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 各紫草樣品經(jīng)粉碎后參考文獻(xiàn)方法制備得質(zhì)控樣品（QC）和各供試品溶液，每批次樣品重復(fù)制備3份。

2.1.2 分析條件 本實(shí)驗(yàn)采用LC20ADXR液相色譜儀聯(lián)合QTRAP4000質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行分析，運(yùn)用MarkerView軟件提取數(shù)據(jù)，參數(shù)設(shè)置參考文獻(xiàn)［14］，采用雙氯芬酸鉀峰294.1/250.0/12.8校正后的峰面積構(gòu)建變量數(shù)據(jù)矩陣，用于后續(xù)主成分分析，變量縮放方式均采用等方差法。

為了考察儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性和色譜峰的重現(xiàn)性，參考文獻(xiàn)［15］方法設(shè)置QC進(jìn)樣順序，結(jié)果顯示貫穿整個(gè)樣品批的QC樣品中各特征峰的相對(duì)峰面積和保留時(shí)間RT值的RSD值分別在3.1%～8.6%和0.1%～2.5%之間。說(shuō)明系統(tǒng)重現(xiàn)性良好，測(cè)定變量的差異不是由儀器的不穩(wěn)定造成的，而是由樣品本身的差異引起，見(jiàn)圖1。

圖1 QC樣品的總離子流色譜圖

2.1.3 藥用紫草UHPLC-QTRAP-MRM特征輪廓譜的建立 將22批紫草飲片按“2.1.2”項(xiàng)制得供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄各批次樣品色譜數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3針，參考文獻(xiàn)對(duì)各特征峰進(jìn)行定性鑒別。

2.2 數(shù)據(jù)處理方法 采用MarkerView軟件提取數(shù)據(jù)的參數(shù)設(shè)置：高斯平滑寬度：3個(gè)點(diǎn)；噪音百分比：50.0%；基線扣除窗口：8.0 min；峰分裂因子：2個(gè)點(diǎn)；是否限制每張圖提一個(gè)峰：否；保留時(shí)間公差：0.50 min；最低峰強(qiáng)度：200 cps；最小峰寬度：4 points；最小信噪比：5.0；最大峰數(shù)目：500；采用內(nèi)標(biāo)雙氯芬酸鉀校正后的峰面積構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，用于主成分分析及主成分判別分析，變量縮放方式均采用等方差法。

2.3 基于主成分分析及主成分判別分析的紫草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià) 無(wú)監(jiān)督的PCA模型（圖2A，2B）觀察樣品的自然聚集狀態(tài)，結(jié)果顯示新疆紫草分布于第一、二象限，硬紫草和內(nèi)蒙古紫草分布于第四象限；但是各紫草樣品組內(nèi)分布呈明顯分散趨勢(shì)，提示來(lái)源于不同產(chǎn)地紫草飲片所含化學(xué)成分的組成和含量顯著不同；另外硬紫草與內(nèi)蒙古紫草相互靠近并集中在一處，說(shuō)明就化學(xué)成分而言?xún)烧呖赡芨咏?，該結(jié)果從化學(xué)成分方面驗(yàn)證了市場(chǎng)上通常將內(nèi)蒙古紫草也歸屬于硬紫草的做法有一定科學(xué)依據(jù)，也說(shuō)明LC-MS/MS技術(shù)完全有可能作為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒別的補(bǔ)充工具，通過(guò)表征化學(xué)成分應(yīng)用于藥材品種的區(qū)分和鑒別。

PCA-DA模型（圖2C，2D）顯示新疆紫草分布于第一、四象限；硬紫草分布于第三象限，內(nèi)蒙古紫草分布于第二象限，說(shuō)明不同品種紫草化學(xué)成分的組成和含量表現(xiàn)出較大差異。此外，新疆紫草被投影在一個(gè)較大區(qū)域，硬紫草呈分散分布，區(qū)域分布的不同說(shuō)明相同品種紫草化學(xué)成分也存在較大差異，但是內(nèi)蒙古紫草的分布態(tài)勢(shì)需擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步觀察。眾所周知，中藥材的化學(xué)成分除受本身的遺傳物質(zhì)影響外，還受產(chǎn)地自然條件、采收加工、炮制等環(huán)節(jié)的多方面影響。本實(shí)驗(yàn)紫草樣品來(lái)源于中國(guó)新疆南部、中國(guó)新疆北部、巴基斯坦、阿富汗等6個(gè)產(chǎn)地，各地的日照時(shí)間，降水條件和土壤環(huán)境等差異造成藥材間的代謝成分差異較大。然而，產(chǎn)地的差異并沒(méi)有影響三個(gè)品種的分類(lèi)趨勢(shì)，說(shuō)明相對(duì)于外部生態(tài)環(huán)境因素，內(nèi)部遺傳因素對(duì)藥材有效成分的影響更大。

為了發(fā)現(xiàn)可能的代謝差異物，找出引起三種紫草品種分類(lèi)的內(nèi)在原因，我們進(jìn)一步觀察PCA-DA模型的載荷圖并對(duì)結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)分析（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新疆紫草的色譜峰65（β，β-二甲基丙烯酰紫草素）和色譜峰5（紫草呋喃A）的相對(duì)峰面積顯著低于其他兩種紫草（P＜0.001）；內(nèi)蒙古紫草的色譜峰25（1-甲氧基乙酰紫草素）、色譜峰44（丙酰紫草素）和色譜峰21（紫草呋喃E）的相對(duì)峰面積顯著高于硬紫草（P＜0.001）。說(shuō)明這些化合物為潛在的區(qū)分三種紫草的差異性代謝物。在經(jīng)過(guò)大量樣本驗(yàn)證并測(cè)定各化合物絕對(duì)含量的基礎(chǔ)上，首先根據(jù)化合物β，β-二甲基丙烯酰紫草素和紫草呋喃A的含量將新疆紫草與其他兩種紫草區(qū)分開(kāi)來(lái)，然后利用化合物1-甲氧基乙酰紫草素、丙酰紫草素、紫草呋喃E的含量區(qū)分硬紫草和內(nèi)蒙古紫草。

3 討論

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別法主要是對(duì)天然藥物的自然形態(tài)、對(duì)炮制藥材的外表性狀進(jìn)行觀察，通常沒(méi)有確實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為支撐，主要取決于鑒定者的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行，對(duì)于種內(nèi)變異和種間雜交的鑒別大多模棱兩可。近年來(lái)，色譜技術(shù)作為形態(tài)學(xué)的補(bǔ)充工具，通過(guò)化學(xué)成分表征而廣泛地應(yīng)用于植物品種的區(qū)分。來(lái)源于LC-MS/MS技術(shù)的UHPLCQTRAP-MRM特征輪廓譜尤其適用于復(fù)雜體系及微量成分的定性定量分析。本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建不同來(lái)源紫草的UHPLC-QTRAP-MRM特征輪廓譜數(shù)據(jù)庫(kù)，然后采用主成分分析、主成分判別分析和T檢驗(yàn)分析用于評(píng)價(jià)不同來(lái)源紫草資源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同基源紫草的種間、種內(nèi)化學(xué)成分均不一致，說(shuō)明影響紫草藥材的質(zhì)量除了藥材本身的遺傳因素外，自然環(huán)境和采收標(biāo)準(zhǔn)等因素同樣不可忽視。T檢驗(yàn)結(jié)果初步研究表明β，β-二甲基丙烯酰紫草素、紫草呋喃A、1-甲氧基乙酰紫草素、丙酰紫草素和紫草呋喃E可能為三種紫草的差異性代謝成分，該結(jié)論有待進(jìn)一步深入研究證實(shí)。該研究為區(qū)分不同基源紫草飲片及其全面質(zhì)量控制提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

圖2 藥用紫草的主成分分析圖：A為PCA得分圖；B為PCA載荷圖；C為PCA-DA得分圖；D為PCA-DA載荷圖

圖3 T檢驗(yàn)分析及5個(gè)化合物的峰面積輪廓圖：A為T(mén)檢驗(yàn)分析；B為β，β-二甲基丙烯酰紫草素；C為紫草呋喃A；D為1-甲氧基乙酰紫草素；E為丙酰紫草素；F為紫草呋喃E