韓澤平，麥正均，黎毓光，呂鈺冰，何思華，周嘉彬，何金花

膀胱癌（bladder cancer）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡 性腫瘤之一，每年約有55萬新發(fā)病例和20萬死亡病例，嚴重危害著人類的生命健康。膀胱癌初期癥狀較隱匿，絕大部分患者被確診時已為中晚期，手術(shù)切除腫物聯(lián)合化療是其主要治療方法，但容易復發(fā)轉(zhuǎn)移，5年生存率僅約50%，而且化療不良反應多，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，因此尋找新的治療藥物極為必要。

近年來中草藥逐漸受到人們的關(guān)注，部分天然草本及其有效成分具有抗癌、提高患者免疫力、減輕不良反應以及延長生存期等作用。而且，協(xié)同藥物組合治療比單藥療法更有成效，更有增效減毒，劑量降低的優(yōu)勢。近年研究報道，中藥單體化合物羽扇豆醇（lupeol）與槲皮素（quercetin）（圖1）具有多種抗腫瘤作用，包括有效抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡、減少腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移等。本研究自2019年6月至2020年1月利用噻唑藍（MTT）法分別檢測羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合用藥對膀胱癌細胞增殖及遷移能力的影響，為中藥聯(lián)合應用治療膀胱癌提供理論依據(jù)。

圖1 中藥單體結(jié)構(gòu)：A為羽扇豆醇的結(jié)構(gòu)；B為槲皮素的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

羽扇豆醇購自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；槲皮素、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自SIGMA公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自HyClone公司；青霉素/鏈霉素（P/S）購自美國Thermo scientific公司；RTPCR試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；miRNeasy Mini Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；PCR引物購自中國上海吉瑪生物公司；CO培養(yǎng)箱和Bio-Tek酶標儀ELX-800購自美國Biotech公司；1300B2生物安全柜購自美國Thermo公司；750D照相機購自日本Canon公司；ABI 7900 Real-time PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和藥物處理

膀胱癌5637細胞購自沛瑜生物制品有限公司，細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%P/S的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。羽扇豆醇使用無水乙醇和DMSO（1∶1）溶解，配制成10μmol/L的貯存液；槲皮素使用DMSO溶解，配制成10μmol/L的貯存液，置-20℃保存，用RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋至相應的工作濃度。

1.3 噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖能力

1.3.1 單獨用藥 選擇對數(shù)生長期的膀胱癌5637細胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度至1×10個/毫升，細胞懸液移200微升/孔至96孔板培養(yǎng)24 h。分別加入不同濃度的羽扇豆醇（10、20、40、60、80、100、120μmol/L）和槲皮素（5、10、20、40、80μmol/L）干預膀胱癌細胞48 h，每種濃度5個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT 20μL，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加入150μL DMSO，并于搖床震蕩10 min后，于490 nm波長處測定吸光度A值。計算細胞增殖抑制率、IC及IC，細胞增殖抑制率=（A－A）/（A－A）×100%。

1.3.2 聯(lián)合用藥 根據(jù)1.3.1實驗計算出兩種藥物作用于膀胱癌5637細胞的IC。分別設羽扇豆醇IC組、槲皮素IC組及聯(lián)合作用組，分別給予藥物相應處理48 h后運用MTT法檢測細胞增殖抑制率，并運用金正均法計算出Q值評價聯(lián)合用藥時兩藥間的相互作用。

1.4 集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力

用胰酶消化細胞，再用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)為400個/孔，接種于12孔板中，設羽扇豆醇IC組、槲皮素IC組、聯(lián)合作用組及空白對照組，每孔補足完全培養(yǎng)基至1 mL，在5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每組設3個平行孔。棄去培養(yǎng)液，用PBS浸洗兩次，然后用95%乙醇固定10 min，然后風干，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，蒸餾水沖洗3次，風干后拍照。然后每孔加入10%冰醋酸2 mL，靜止30 min，待結(jié)晶充分溶解，混勻后取100μL于96孔板中，酶標儀讀取560 nm波長處吸光度A值，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（A－A）/A×100%。每組試驗重復3次。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取處于對數(shù)生長期的5637細胞，計數(shù)后每孔以5.0×10個/毫升的細胞懸液2 mL接種至6孔板中，待細胞貼壁后，用200μL槍頭沿孔的縱行直徑劃痕，并在該劃痕左右0.5 cm處各劃一條，劃痕后用PBS洗3次，去除脫落的細胞。設羽扇豆醇IC組、槲皮素IC組、聯(lián)合作用組及空白對照組，分別加入相應藥物的低濃度血清（2%）培養(yǎng)基，放入5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照0、6、12、18 h時間點選取同一視野進行拍照。利用Image J軟件對各組進行劃痕分析，計算遷移率。遷移率（%）=（T0時面積－Tt時面積）/T0時面積×100%。每組試驗重復3次。

1.6 qRT-PCR檢測miR-145的表達水平

取處于對數(shù)生長期的5637細胞，計數(shù)后每孔以5.0×10個/毫升的細胞懸液2 mL接種至6孔板中培養(yǎng)24 h，細胞分組同前，藥物干預48 h后收集細胞。按照試劑盒說明提取各組細胞的總RNA，并按試劑說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應體系合成cDNA。用2μL cDNA作為模板配制25μL RT-PCR的反應體系，反應在ABI 7300 Real-time PCR儀上進行，反應條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。內(nèi)參為U6，設置3個復孔。miR-145的相對表達量用2法計算。miR-145正向引物：5’-ACACTC‐CAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’，反向引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AAC‐GCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2 結(jié)果

2.1 羽扇豆醇和槲皮素單獨對膀胱癌5637細胞的作用

MTT法結(jié)果顯示，不同濃度羽扇豆醇對膀胱癌5637細胞均有抑制作用，隨著羽扇豆醇濃度的增加，抑制率升高，計算得48 h的IC值為50.02μmol/L，IC為35.40μmol/L。槲皮素也能抑制膀胱癌細胞的增殖，呈明顯的劑量-效應關(guān)系，槲皮素作用48 h后的IC、IC值分別為44.42μmol/L、29.86μmol/L。本研究選取接近IC濃度的羽扇豆醇（35μmol/L）和槲皮素（30μmol/L）進行后續(xù)實驗。

2.2 羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合對膀胱癌細胞的抑制作用

羽扇豆醇與槲皮素兩種藥物的IC濃度聯(lián)合能明顯抑制膀胱癌細胞的增殖作用，抑制作用明顯強于兩者單獨作用（P＜0.05），計算得兩者IC聯(lián)合作用的Q值為1.167，Q值大于1.15，提示羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合干預膀胱癌5637細胞產(chǎn)生協(xié)同作用。

2.3 羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合對膀胱癌細胞的克隆形成作用

從圖2所見，藥物處理7 d后，與對照組相比，羽扇豆醇與槲皮素均能抑制膀胱癌5637細胞的克隆形成，在兩種藥物IC聯(lián)合作用下克隆能力抑制的更加明顯。溶解結(jié)晶紫后于酶標儀讀取各孔560 nm吸光度，各組間吸光度差異有統(tǒng)計學意義（F=112.47，P=0.000）。代入公式計算后，藥物聯(lián)合組的克隆抑制率［（74.64±1.70）%］明顯高于單用羽扇豆醇［（32.11±5.27）%］（t=13.30，P=0.000）及單用槲皮素［（50.23±5.18）%］（t=7.75，P=0.001）的克隆抑制率，差異有統(tǒng)計學意義，均P＜0.05。且單用槲皮素組的抑制率高于單用羽扇豆醇（t=4.274，P=0.013）。

圖2 平板法檢測羽扇豆醇與槲皮素對膀胱癌5637細胞克隆形成能力

2.4 羽扇豆醇與槲皮素對膀胱癌5637細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，羽扇豆醇組、槲皮素組及聯(lián)合組均有效抑制膀胱癌5637細胞的遷移能力（圖3）。其中聯(lián)合組的抑制作用最為顯著，18 h的遷移率僅為（37.64±2.49）%，明 顯 低 于 對 照 組（76.83±4.21）%（t=-13.878，P=0.000）、羽扇豆醇組（61.05±5.07）%（t=-7.178，P=0.002）及 槲 皮 素 組（51.11±2.46）%（t=-6.665，P=0.003）。單用羽扇豆醇組的遷移率與單用槲皮素的遷移率差異無統(tǒng)計學意義（t=3.055，P=0.058）。

圖3 羽扇豆醇與槲皮素對膀胱癌5637細胞遷移能力的劃痕實驗圖像（HE染色×40）

2.5 羽扇豆醇與槲皮素對膀胱癌5637細胞miR-145表達的影響

羽扇豆醇和槲皮素單獨干預5637細胞48 h后，均可使miR-145的相對表達量升高（P＜0.01），但兩者間的miR-145相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。聯(lián)合組的miR-145相對表達量顯著高于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)今治療手段主要以手術(shù)和化療為主，但復發(fā)率較高，且常規(guī)化療藥物對患者有一定程度的副作用，尋找新的抗癌藥物尤為必要。在腫瘤治療方面，傳統(tǒng)中藥具有全面、低毒、促進免疫調(diào)節(jié)等特點，優(yōu)于放化療。隨著中藥驅(qū)邪扶正的機理及促進人體免疫力的研究進展，中藥在預防癌癥和治療早期癌癥，甚至中晚期抗癌的應用方面將具有明顯的優(yōu)勢。

羽扇豆醇是一種五環(huán)三萜類化合物，分子量426.72，分子式C30H50O，廣泛存在于多種水果、蔬菜和中藥等植物當中。據(jù)報道，羽扇豆醇具有多種藥理學活性作用，包括抗癌、抗炎、心臟病、抗糖尿病等。研究報道，羽扇豆醇可誘導小鼠黑色素瘤和人白血病細胞的分化并抑制其增殖；抑制小鼠二期皮膚癌的發(fā)展進程，抑制胰腺癌細胞的生長和誘導凋亡；在體內(nèi)外對前列腺癌都有增值抑制和誘導凋亡的作用，然而關(guān)于羽扇豆醇對膀胱癌作用的研究甚少。槲皮素是一種黃酮類化合物，分子量302，分子式C15H10O7，廣泛存在于許多植物的花、葉、果實當中。槲皮素具有多種藥理活性作用，包括抗纖維化作用、抗炎、降低血壓、保護心肌缺血再灌注損傷、抗病毒、鎮(zhèn)痛等。此外，槲皮素對鼻咽癌、肝癌、前列腺癌、白血病、胃癌及視網(wǎng)膜母細胞瘤等多種腫瘤細胞均有抑制的作用，是頗具應用前景的抗癌藥物之一。

腫瘤的聯(lián)合用藥是指利用不同藥物之間的協(xié)同作用以取得比單一藥物更好的效果，通過減低藥物劑量達到減少藥物毒副作用目的，并增強藥物療效，有效抑制腫瘤生長，防止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究檢測了不同濃度的羽扇豆醇和槲皮素單獨作用于膀胱癌細胞的生長抑制率，結(jié)果顯示兩種藥物單獨作用于膀胱癌細胞均具有增值抑制作用，并且抑制率與藥物濃度呈依賴性。為了減少藥物的毒副作用，本研究降低藥物作用濃度，采用羽扇豆醇與槲皮素的IC濃度聯(lián)合干預膀胱癌5637細胞。根據(jù)MTT實驗得出兩種藥物的IC，將兩種藥物IC聯(lián)合算出Q值來判斷兩種藥物聯(lián)合效果，結(jié)果顯示Q值為1.167，大于1.15，表明羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合作用產(chǎn)生協(xié)同作用，聯(lián)合作用組對細胞的抑制增殖效果明顯高于單獨作用組。進一步的研究證明了，與單獨用藥組比較，聯(lián)合組可顯著抑制5637細胞克隆形成能力及細胞遷移能力。

微小RNA（microRNAs，miRNAs，miR）是一類長度為18～22個堿基對組成的非編碼RNA，大量研究證實miRNA的異常表達與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）在多種腫瘤組織中呈低表達，起著抑癌基因的作用，當原癌基因被激活時，miR-145的表達被抑制，不能發(fā)揮其正常功能，導致腫瘤的發(fā)生。多項研究證實，miR-145在膀胱癌中明顯下調(diào)，上調(diào)其表達可有效抑制膀胱癌細胞增殖并可促進細胞凋亡。據(jù)報道，多種藥物或基因治療手段可通過激活miR-145通路，上調(diào)膀胱癌細胞中miR-145的表達水平，進而抑制膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展。qRT-PCR結(jié)果顯示，羽扇豆醇與槲皮素單獨作用及聯(lián)合作用5637細胞均可使miR-145表達升高，且聯(lián)合作用組升高最為顯著。另外，miR-145是膀胱癌在內(nèi)的多種癌癥上皮間葉轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchvmal transition，EM）調(diào)節(jié)劑，其表達增高也可抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究中，羽扇豆醇與槲皮素聯(lián)合作用5637細胞后，使胞內(nèi)miR-145相對表達量明顯增高從而達到抑癌效果，但其具體分子機制有待進一步研究。