李素素，常 艷，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

色氨酸2,3-雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase，TDO2)是犬尿氨酸代謝通路(kynurenine pathway，KP)的初始限速酶之一，能夠催化色氨酸(tryptophan，Trp)代謝為犬尿氨酸(kynurenine，Kyn)和其他活性代謝產(chǎn)物，包括犬尿喹啉酸、喹啉酸和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸等。TDO2首次發(fā)現(xiàn)于大鼠肝臟，受糖皮質(zhì)激素及L-Trp的誘導(dǎo)。Trp是TDO2的唯一底物，TDO2具有分解代謝Trp的高度特異性。TDO由TDO2基因編碼，具有4個(gè)亞基[1]。TDO2的整體結(jié)構(gòu)為同源四聚體，由406個(gè)氨基酸組成。約90%的Trp由肝臟中TDO2降解，可維持血液中Trp水平的穩(wěn)定[2]。

研究表明，TDO2與神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生理密切相關(guān)，如阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)、抑郁癥和精神分裂癥等。新近研究發(fā)現(xiàn)，TDO2在多種腫瘤中均有高表達(dá)，主要通過(guò)直接作用于腫瘤細(xì)胞以及間接調(diào)控免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。相關(guān)報(bào)道同時(shí)發(fā)現(xiàn)TDO2與多發(fā)性硬化癥等炎癥免疫相關(guān)性疾病有關(guān)，但具體作用尚不清楚[3,7-8]。因此，本課題組采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TDO2基因敲除(TDO2 gene knockout，TDO2-KO)小鼠模型，在蛋白水平進(jìn)行了驗(yàn)證，并進(jìn)行了初步表型研究，以期在動(dòng)物水平上進(jìn)一步探究TDO2基因的功能學(xué)特性以及在疾病病理機(jī)制中的作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建TDO2-KO小鼠，本工作與南京集萃藥康生物科技公司實(shí)驗(yàn)室合作完成。野生型(wild type，WT)小鼠(C57BL/6J)購(gòu)自南京集萃藥康生物科技公司，合格編號(hào)(201908136)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作及飼養(yǎng)均符合安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑RNA提取試劑(批號(hào)：213408)(美國(guó)Invitrogen公司)；TIANamp Genomic DNA Kit(批號(hào)：PT4503)(天根生化科技公司)；Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：R201)和TB GreenTMFast qPCR Mix反應(yīng)試劑(批號(hào)：Q302-1)(日本TaKaRa公司)；蛋白酶K(批號(hào)：AM2546)(美國(guó)Sigma公司)；抗β-actin抗體(批號(hào)：10004156)、抗TDO2抗體(批號(hào)：00049827)和辣根過(guò)氧化物酶山羊抗兔/小鼠二抗(批號(hào)：202700514/142637)(美國(guó)Proteintech公司)；TE Buffer(批號(hào)：12090015)、1 mol·L-1Tris-HCl(批號(hào)：ST768)、0.5 mol·L-1EDTA(批號(hào)：WK180920-2)、PMSF(批號(hào)：P0100)、RIPA裂解液(批號(hào)：040920200709)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號(hào)：BB3702)和BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：BB19071)(上海貝博生物公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)：161204-34)(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 儀器PCR自動(dòng)系列化分析儀MYCYDER、電泳儀BIO-RAD powerpac 164-5070(美國(guó)Bio-Rad公司)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)Tanon-1600(上海天能公司)；化學(xué)發(fā)光成像分析LAS4000Mini(美國(guó)GE Healthcare公司)。

2 方法

2.1 TDO2-KO小鼠的構(gòu)建

2.1.1CRISPR-Cas9靶向位點(diǎn)的設(shè)計(jì)及sgRNA的合成 根據(jù)Gene ID小鼠基因組序列信息和打靶位點(diǎn)側(cè)翼序列信息，設(shè)計(jì)針對(duì)TDO2基因的第3-8號(hào)外顯子特異性打靶位點(diǎn)的sgRNA(Fig 1)，為確保能完全敲除TDO2的基因組DNA序列，選擇4個(gè)特異性sgRNA序列，其基因組位置及序列見Tab 1。

Tab 1 sgRNA sequence information

2.1.2Cas9 mRNA和sgRNA顯微注射導(dǎo)入小鼠受精卵 待♀ C57BL/6小鼠超數(shù)排卵后收集受精卵細(xì)胞，Cas9和sgRNA終濃度分別為0.1 g·L-1和0.05 g·L-1。采用顯微操作系統(tǒng)將Cas9 mRNA和sgRNA混合液注射至C57BL/6J小鼠受精卵的胞質(zhì)中，在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)受精卵細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞發(fā)育至細(xì)胞胚胎階段時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至同周齡假孕的C57BL/6J雌鼠輸卵管腹部，得到4只F0代小鼠(Fig 2)。

Fig 1 TDO2-KO strategyThe Cas9 protein binds to the target site under the guidance of sgRNA to cause DNA double-strand breaks,thereby achieving the deletion of the base sequence of the Exon3-8,and finally achieving TDO2 gene knockout.

Fig 2 Cas9 mRNA and sgRNA microinjected into zygotes of miceAfter embryos were cultured to the two-cell stage,followed by transfer into abdomen of fallopian tube of pseudo pregnant females.Mutations in TDO2 Exon 3-8 in F1 female mice were detected.

2.2 TDO2-KO小鼠的飼養(yǎng)和繁殖TDO2-KO小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中，溫度(22 ℃-28 ℃)；相對(duì)濕度(40%-60%)；換氣(10-20次·h-1)；噪音(<60 dB)；每周2次更換鼠籠、墊料和飲用水；自由飲食和飲水，定時(shí)喂少量葵花籽；每天記錄環(huán)境數(shù)據(jù)和小鼠狀況(飲食、活動(dòng)及全身情況)；孕鼠妊娠期一般20 d左右；小仔出生5-7 d可進(jìn)行剪尾和剪腳趾編號(hào)操作；19-21 d可進(jìn)行分籠操作，幼鼠離乳，并將雌雄小鼠分開飼養(yǎng)；一般雄鼠8周，雌鼠6周左右大小性成熟，可用于配繁。

鑒定后的陽(yáng)性F0代小鼠和WT小鼠回交得到的后代稱為F1代小鼠。F1代小鼠需要根據(jù)PCR來(lái)鑒定刪除片段的大小，確定陽(yáng)性F1代小鼠并分別保種建系。

2.3 TDO2-KO小鼠PCR鑒定

2.3.1提取小鼠尾部組織基因組DNA F0代小鼠出生1周后，取小鼠尾尖部0.3 cm于EP管中。然后加入500 μL裂解液，消化過(guò)夜。次日，搖晃EP管使消化好的組織均勻。每管加入500 μL等體積的酚/氯仿混合溶液混勻，12 000 r·min-1離心15 min。吸取300 μL上清轉(zhuǎn)移至新的EP管，每管加入2倍于上清體積的100%乙醇，混勻，12 000 r·min-1離心10 min。棄上清，再加入800 μL 70%乙醇，12 000 r·min-1離心5 min。棄上清，晾干。加入100 μL TE溶液溶解DNA，37 ℃助溶，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2PCR鑒定

2.3.2.1 引物信息：KO：F1:TCTGCTATGGCACGTTGAGTGGTG;R1:ATGTGGTGGTGAACATCTGTAATCC;WT：F2:TAATCTCCTGGGTGTTGTAAGTGTGG;R2:CTAACCTTGGGAAGACGTTAAGTCC

2.3.2.2 PCR體系：反應(yīng)體系25 μL；分別加入ddH2O 9.5 μL，Taq Master Mix，Dye Plus各12.5 μL，引物各1 μL，模板cDNA 1 μL。PCR儀擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，20個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min 終止反應(yīng)。

2.3.2.3 電泳：將2.0 μL溴酚藍(lán)加入到PCR產(chǎn)物中，混勻，每孔點(diǎn)樣5 μL，Marker對(duì)照。140-150 V電壓，觀察條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)情況，20-30 min后結(jié)束電泳，拍照觀察。

2.3.2.4 鑒定結(jié)果判讀：根據(jù)鑒定報(bào)告，對(duì)比PCR條帶，得出結(jié)論。PCR反應(yīng)未獲得500 bp條帶但獲得252 bp條帶的為WT小鼠；PCR反應(yīng)獲得500 bp條帶也獲得252 bp條帶的為雜合小鼠；PCR反應(yīng)獲得500 bp條帶但未獲得252 bp條帶的為TDO2-KO小鼠。

2.4 TDO2-KO小鼠生長(zhǎng)和繁育能力觀察TDO2-KO小鼠的飲食、活動(dòng)、全身情況、發(fā)育生長(zhǎng)狀態(tài)等變化，觀察TDO2-KO小鼠的繁殖能力。

2.5 Western blot 檢測(cè)TDO2-KO小鼠肝臟中TDO2蛋白的表達(dá)勻漿裂解WT和F3代純合子小鼠肝臟組織，提取小鼠肝組織總蛋白，BCA法蛋白定量，計(jì)算濃度，依次上樣。采用12%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，37 ℃搖床封閉2 h，孵育TDO2一抗(1 ∶500)，4 ℃過(guò)夜，次日用TPBS洗，3次/10 min，加入山羊抗兔IgG(1 ∶20 000)，37 ℃孵育2 h。TPBS 洗，3次/10 min，PBS洗，1次/10 min，采集圖像，定影。

3 結(jié)果

3.1 TDO2-KO小鼠鑒定結(jié)果受精卵顯微注射，胚胎移植后，獲得了F0代小鼠，由于F0代為嵌合小鼠，無(wú)法穩(wěn)定遺傳，陽(yáng)性F0代小鼠需要與WT回交，獲得可穩(wěn)定遺傳的F1代雜合子小鼠。陽(yáng)性F1代雜合子小鼠之間配繁，獲得F2代純合子小鼠，F(xiàn)2代純合子小鼠之間繼續(xù)配繁，成功繁殖出更多的TDO2-KO純合子小鼠。陽(yáng)性F0代雜合子小鼠與WT配繁得F1代小鼠，部分小鼠基因型鑒定結(jié)果見(Fig 3A)，其中32、33、35、36、38-40、42、44號(hào)出現(xiàn)1條252 bp 的條帶，為WT小鼠；34、37、41、43、45-51號(hào)分別出現(xiàn)500 bp和252 bp兩條條帶，為雜合子小鼠；F1代陽(yáng)性雜合子小鼠之間合籠配繁，產(chǎn)生F2代小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)，結(jié)果見(Fig 3B、3C)，其中100、103-106號(hào)出現(xiàn)500 bp和252 bp的兩條條帶，為雜合子小鼠；101、108-111、113只出現(xiàn)1條500 bp左右條帶，為純合子小鼠；102、112、114-116號(hào)出現(xiàn)1條252 bp的條帶，為WT小鼠。分別挑選♀、♂純合子基因型小鼠進(jìn)行擴(kuò)繁，得到的 F3代及以后只出現(xiàn)1條500 bp左右條帶(Fig 3D)，173-185號(hào)全部為基因敲除純合子小鼠。

3.2 TDO2-KO小鼠的生長(zhǎng)和繁育情況與WT小鼠相比，TDO2-KO小鼠飲食、發(fā)育和體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，皮膚、毛色無(wú)明顯差異。母鼠妊娠期為19-21 d，每胎產(chǎn)3-5只幼鼠，成活率>90%，TDO2-KO小鼠與WT小鼠繁殖情況無(wú)差異。

3.3 Western blot 檢測(cè)TDO2-KO小鼠肝臟中TDO2蛋白的表達(dá)為了在蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證，我們選取了TDO2表達(dá)較高的肝臟組織觀察其表達(dá)。如Fig 4所示，Western blot檢測(cè)WT小鼠肝臟中可見TDO2蛋白的表達(dá)，TDO2基因敲除純合子小鼠肝臟無(wú)TDO2蛋白表達(dá)。

Fig 3 Results of genotype identification of mice by PCRP was positive control,B6 was negative control,and N was blank control；DL2000 marker：2000 bp/1000 bp/750 bp/500 bp/250 bp/100 bp；A:Genotype identification of F1 generation mice;B,C:Genotype identification of F2 generation mice;D:Genotype identification of F3 generation mice.

Fig 4 TDO2 expression in liver of WT and TDO2-KO mice

4 討論

TDO2是KP代謝通路的重要限速酶之一，可以調(diào)節(jié)系統(tǒng)Trp水平和肝臟Kyn水平[10]。TDO2主要表達(dá)于肝臟，但在其他器官、組織中也有少量表達(dá)，如腦、皮膚、睪丸、附睪、胎盤和妊娠子宮。TDO2可由糖皮質(zhì)激素和Trp誘導(dǎo)，前列腺素也可調(diào)控TDO2的表達(dá)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，TDO2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和炎癥免疫相關(guān)性疾病的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

TDO2表達(dá)異常引起Trp耗竭和Kyn的積累，使KP代謝異常紊亂，從而介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。TDO2在神經(jīng)元中表達(dá)，與神經(jīng)組織生理功能密切相關(guān)。TDO2基因的一些內(nèi)含子和外顯子變異導(dǎo)致與精神疾病相關(guān)的多態(tài)性，如Tourette綜合征和自閉癥。TDO2的高表達(dá)介導(dǎo)KP異常，引起下游代謝產(chǎn)物的過(guò)度產(chǎn)生，例如可增加喹啉酸在腦中的積累，參與AD的病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)在果蠅AD模型中，TDO2基因干擾，減少KP代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，可以緩解AD的發(fā)生發(fā)展[12]。新近研究發(fā)現(xiàn)，TDO2在腫瘤中也發(fā)揮重要作用。TDO2在肝癌、乳腺癌、肺癌和直腸癌等多種腫瘤中均高表達(dá)，而且腫瘤細(xì)胞中TDO2的高表達(dá)可直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，同時(shí)TDO2通過(guò)消耗免疫細(xì)胞增殖所需的Trp以及產(chǎn)生中間代謝物Kyn，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[5]?；赥DO2參與免疫反應(yīng)的作用，學(xué)者們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TDO2與多發(fā)性硬化癥、肺炎球菌腦膜炎、肝纖維化等炎癥免疫相關(guān)性疾病的病理機(jī)制有密切聯(lián)系。但目前TDO2如何參與炎癥免疫相關(guān)性疾病的分子機(jī)制研究較少。

傳統(tǒng)的基因敲除手段有基因打靶和基因捕獲技術(shù)。CRISP/Cas9系統(tǒng)是新開發(fā)的基因編輯技術(shù)[13]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9核酸內(nèi)切酶和CRISPR基因組成。它主要利用特異性的sgRNA引導(dǎo)、定位并識(shí)別目的基因特異性位點(diǎn)，將Cas9的核酸酶定位到基因組上的靶點(diǎn)，誘導(dǎo)其發(fā)生缺失突變。與其他技術(shù)相比，這種方法具有基因組編輯特異性強(qiáng)、打靶效率高、方法操作簡(jiǎn)單、適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄sgRNA，將Cas9、sgRNA同時(shí)注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在sgRNA引導(dǎo)下結(jié)合到靶位點(diǎn)第3-8號(hào)外顯子進(jìn)而造成DNA雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)第3-8號(hào)外顯子堿基序列缺失，最終實(shí)現(xiàn)TDO2基因敲除。顯微注射法是將Cas9 mRNA和sgRNA傳遞給受精卵的常用方法[16]。本課題組利用CRISPR-Cas9技術(shù)，成功構(gòu)建TDO2-KO小鼠，在繁殖中未發(fā)現(xiàn)有差異，子代生長(zhǎng)狀況良好。通過(guò)PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，后續(xù)繁殖的純合子小鼠中TDO2表達(dá)缺失，表明基因缺失具有遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)采用Western blot檢驗(yàn)小鼠TDO2表達(dá)較多的肝臟組織。結(jié)果表明，與WT小鼠相比，TDO2-KO小鼠肝臟中無(wú)TDO2蛋白表達(dá)，說(shuō)明TDO2基因敲除成功，與PCR結(jié)果一致。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建TDO2-KO小鼠模型，對(duì)其表型進(jìn)行了初步研究。為進(jìn)一步研究TDO2基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，以及為TDO2在疾病病理機(jī)制中的調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。