石淇允，譚旭儀，李無陰，盧 敏

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院藥物實驗室，河南 洛陽 471002)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨退行性病理改變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為基礎(chǔ)的疾患，臨床上早期癥狀表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛，隨著病情進展出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)活動受限，關(guān)節(jié)畸形、骨摩擦感、肌肉萎縮等[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)KOA在中老年人群發(fā)病較多，尤其是在65歲以上人群中發(fā)病率可高達50%左右。隨著我國人口老齡化的上升趨勢，有學(xué)者預(yù)測到2050年KOA將成為第4大致殘性疾病。但病因仍不明確，多認為其發(fā)生可能與年齡、炎癥、創(chuàng)傷、異常應(yīng)力等因素密切相關(guān)[2]。對其治療措施主要為緩解癥狀、矯正膝關(guān)節(jié)畸形、改善關(guān)節(jié)功能，延緩疾病的發(fā)展進程，提高患者的生活質(zhì)量[1]。部分指南[1,3]已明確指出常用西藥如NSAIDs類藥物、鎮(zhèn)痛藥和SYSADOAs等短期效果顯著，但長期服用不良反應(yīng)較多。

有學(xué)者[4]提出中醫(yī)藥治療KOA雖然效果顯著，但其具體作用機制和長期療效尚無較新高級別的研究證據(jù)支持。因此，探究中醫(yī)藥治療KOA的詳細作用機制，可更好的為應(yīng)用中醫(yī)藥治療本病提供理論支持。課題組在前期的臨床觀察和實驗研究[5-6]均證實了獨活寄生湯能夠緩解KOA患者疼痛，抑制膝關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，改善膝關(guān)節(jié)功能，但其具體的作用靶點和作用機制尚不明確。因此，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索獨活寄生湯治療KOA的可能的作用機制，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索關(guān)鍵詞“獨活寄生湯(獨活，桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風、川芎、人參、當歸、白芍、熟地黃、甘草)”獲得其活性成分信息，并設(shè)置其口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件。

1.2 藥物作用靶點預(yù)測與疾病靶點查詢在TCMSP中進行檢索，獲取化合物的靶點，并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)UniprotKB檢索功能對各靶點人類基因簡稱進行查詢轉(zhuǎn)化，獲取獨活寄生湯中可能存在的相關(guān)基因靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://auth.lifemapsc.com)中以“knee osteoarthritis”為檢索詞進行檢索，獲取KOA的已知相關(guān)基因。

1.3 共同靶點的確定在相關(guān)網(wǎng)站(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中導(dǎo)入藥物作用靶點和疾病作用靶點的相關(guān)基因數(shù)據(jù)，并繪制Venny圖獲取藥物(獨活寄生湯)靶點與疾病(KOA)靶點的交集為共同靶點。

1.4 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將確定的藥物疾病共同靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.2(美國)構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape3.7.2中網(wǎng)絡(luò)分析(Network analyzer)功能，對節(jié)點連接度(Degree)、介度(BC)和緊密度(CC)進行分析，以獲取獨活寄生湯治療KOA的主要活性成分。

1.5 蛋白相互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將取交集后的靶點導(dǎo)入在線系統(tǒng)String11.0(http://string-db.org/)，獲得蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，并將相關(guān)參數(shù)保持默認設(shè)置，篩選出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點。

1.6 生物通路的分析對獨活寄生湯中的有效作用靶標進行基因本體論(GO)分析與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，得到通路富集結(jié)果，將相關(guān)篩選標準設(shè)置為P<0.01，篩選出有明顯意義的通路并進行排名，將較為靠前且具有臨床意義的通路進行描述。

2 結(jié)果

2.1 獨活寄生湯的活性成分及相應(yīng)靶蛋白共檢索出1 600種獨活寄生湯所含的有效活性成分，去重后得到符合標準的成分154種(Tab 1)。有效活性成分數(shù)量最多的是槲皮素，山奈酚和β-谷甾醇等化合物(Tab 2)。

Tab 1 Statistics of drug-active ingredients-target information

Tab 2 Active pharmaceutical ingredients of Duhuo Jisheng decoction

2.2 藥物靶點預(yù)測及共同靶點的確定在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中共得到130個基因靶標。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://auth.lifemapsc.com)中獲取創(chuàng)已知的疾病靶點1 878個。取兩者交集為共同靶點，共63個(Fig 1，Tab 3)。

Fig 1 Common target

2.3 成分-靶點與疾病靶點網(wǎng)絡(luò)將預(yù)測的63個蛋白構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖并分析發(fā)現(xiàn)共有靶蛋白的節(jié)點202個，表示相互作用的線868條，成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點連接度的均值為8.59，中位數(shù)為5。槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、漢黃連素、黃芩素、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、異鼠李素這8種成分的度值均大于所有度值的2倍中位數(shù)(Tab 4)，而度值越大說明這些成分與靶點的關(guān)聯(lián)數(shù)量越多，因此可以推測這些成分是獨活寄生湯治療KOA的主要活性物質(zhì)。

Tab 3 Potential target

Tab 4 Topological parameters of main active ingredients

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用String數(shù)據(jù)庫獲取獨活寄生湯治療KOA相關(guān)靶標的相互作用關(guān)系，導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖并進行分析發(fā)現(xiàn)共有節(jié)點62個，線690條，平均節(jié)點度值為22.25，度值中位數(shù)為20。IL6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC這7個靶點的度值均大于所有度值的2倍中位數(shù)，而度值越大說明這些成分與靶點的關(guān)聯(lián)數(shù)量越多(Fig 2)。

Fig 2 Core protein in protein interaction network diagram

2.5 GO生物學(xué)功能分析將63個潛在靶點映射到DAVID數(shù)據(jù)庫中，進行生物學(xué)功能富集，共富集到68條生物過程，篩選出獨活寄生湯治療KOA的P值最小的前42個生物學(xué)功能并繪制其氣泡圖(Fig 3)。其中P<0.01 的生物過程共有41條。

2.6 KEGG通路分析運用R語言對所有靶點進行KEGG通路富集分析共篩選出117條相關(guān)通路，對P值最小的20條通路繪制相關(guān)條形圖(Fig 4)。有91(P<0.01)條通路與獨活寄生湯治療KOA的作用相關(guān)，如：hsa05210(Apoptosis)、hsa04933(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、hsa04668(TNF signaling pathway)等基因通路。

Fig 3 GO function enrichment analysis bubble chart1：DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase Ⅱ-specific;2：nuclear receptor activity;3：transcription factor activity,direct ligand regulated sequence-specific DNA binding;4：RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding;5：ubiquitin-like protein ligase binding;6 ：endopeptidase activity;7 ：steroid hormone receptor activity;8 ：steroid binding;9：ubiquitin protein ligase binding;10 activating transcription factor binding;11 integrin binding;12 ：kinase regulator activity;13：cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process;14：repressing transcription factor binding;15 ：histone deacetylase binding;16 ：cysteine-type endopeptidase activity;17 ：protein phosphatase binding;18 ：nuclear hormone receptor binding;19：protein kinase regulator activity;20 ：cysteine-type peptidase activity;21 ：phosphatase binding;22：hormone receptor binding;23：estrogen receptor binding;24：transcription cofactor binding;25：E-box binding;26 ：p53 binding;27 ：SMAD binding;28 ATPase binding;29 ：steroid hormone receptor binding;30 ：protease binding;31 ：heme binding;32 ：growth factor binding;33 ：RNA polymerase Ⅱ basal transcription factor binding;34 ：transcription coactivator binding;35：NF-kappaB binding;36 ：Hsp90 protein binding;37：cyclin-dependent protein serine/threonine kinase regulator activity;38：RNA polymerase Ⅱ activating transcription factor binding;39 ：core promoter binding;40 ：glutathione binding;41 ：oligopeptide binding;42 ：MAP kinase activity.

Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis bar chart1 ：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications;2 ：Fluid shear stress and atherosclerosis;3 ：Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection;4：Colorectal cancer;5 ：Apoptosis;6 ：Apoptosis - multiple species;7 ：TNF signaling pathway;8：Prostate cancer;9 ：Hepatitis B;10 ：Measles;11 ：Salmonella infection;12 ：Legionellosis;13 ：Human cytomegalovirus infection;14 ：Epstein-Barr virus infection;15 ：Prolactin signaling pathway;16 ：Proteoglycans in cancer;17：Platinum drug resistance;18：Pertussis;19：Toxoplasmosis;20：Pathogenic Escherichia coli infection

3 討論

3.1 基礎(chǔ)理論探析不同的學(xué)者根據(jù)KOA的發(fā)病特點，對該病從多個方面進行治療。如邢振龍等[7]從“肝、脾、腎”論治KOA；鄺高艷[5]等也曾提出“毒、瘀”是KOA的主要病機；馬浩哲等[8]提出從“虛、瘀”論治KOA；而譚旭儀等[9]總結(jié)多數(shù)醫(yī)家的理念認為“虛、毒、瘀”是KOA的主要病機，并選用獨活寄生湯治療KOA，療效顯著。獨活寄生湯[10]最早被《備急千金要方》收錄，是骨傷科常用方劑之一，該方由獨活，桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風、川芎、人參、當歸、白芍、熟地黃、甘草這15味中藥組合而成，以獨活、桑寄生為君藥，具有補肝腎、祛風濕和止痹痛的臨床療效。

3.2 有效成分研究本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從有效成分、通路和基因蛋白等方面綜合探索評價獨活寄生湯治療KOA的作用效果。對獨活寄生湯的活性成分和KOA相應(yīng)的靶標進行搜索、篩選，得到符合標準的有63個。進一步構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、異鼠李素這8種成分與治療疾病的相關(guān)性較高，結(jié)合文獻報道及實驗室研究總結(jié)[11-12]發(fā)現(xiàn)，這些有效成分主要與調(diào)控成骨或軟骨細胞的代謝平衡、抗氧化、改善內(nèi)環(huán)境的炎癥反應(yīng)等機制密切相關(guān)。如槲皮素能夠抗炎、抗氧化，也有研究[11]證實了槲皮素具有促進成骨分化的作用，同時抑制骨吸收。袁真等[12]通過實驗證實了山奈酚能夠增加骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)。因此，獨活寄生湯治療KOA的主要有效成分可能為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、異鼠李素。

3.3 基因表達淺析對本研究PPI網(wǎng)絡(luò)分析可知，IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC這幾種蛋白質(zhì)超過所有度值的2倍中位數(shù)，這說明獨活寄生湯的活性成分與這些蛋白具有較高的結(jié)合活性。檢索相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)IL-6(interleukin 6)是一種內(nèi)源性熱原，能夠在自身免疫性疾病或感染患者中引起發(fā)熱。這種蛋白質(zhì)與多種炎癥相關(guān)疾病狀態(tài)有關(guān)，在炎性部位它被分泌到血清中，并通過白細胞介素6受體α誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄形成炎癥反應(yīng)[13]。VEGFA(vascular endothelial growth factor A)是一種與血管新生有關(guān)的因子，該生長因子能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，同時與炎性指標、疾病活動及功能指標具有正相關(guān)，也可參與固有免疫調(diào)節(jié)[14]。ALB(albumin)在調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓中起作用，并充當多種內(nèi)源性分子(包括激素，脂肪酸和代謝產(chǎn)物)以及外源性藥物的載體蛋白[15]，可能與KOA發(fā)生腫脹等密切相關(guān)。以上也證實了通過PPI網(wǎng)絡(luò)所篩選的靶點蛋白的確與KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC可能為獨活寄生湯治療KOA的關(guān)鍵靶點蛋白。

3.4 生物學(xué)功能和信號通路探索從GO功能富集結(jié)果分析可知，獨活寄生湯治療KOA的潛在靶點多與炎性細胞因子的調(diào)控和骨與軟骨細胞的代謝等生物學(xué)過程相關(guān)。復(fù)習(xí)相關(guān)文獻[16]可知在正常生理情況下，炎性細胞因子(如hs-CRP、IL-6等)及骨與軟骨細胞的代謝物質(zhì)(CASP3、MAPK8、MYC等)在KOA的發(fā)病過程中具有重要的影響及調(diào)節(jié)作用。而膝關(guān)節(jié)軟骨的退變、半月板及周圍軟組織損傷、下肢力線異常等可導(dǎo)致IL-6、hs-CRP等炎性細胞因子和MMPs、CDK4、BMP-2、CASP3、MAPK8等細胞因子含量的異常，這些細胞因子可以誘發(fā)多種凋亡誘導(dǎo)信號，破壞軟骨細胞的正常代謝，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和半月板退變。KEGG 通路富集分析結(jié)果可知，在獨活寄生湯治療KOA的過程中主要涉及的通路可能是與代謝相關(guān)通路、腫瘤壞死因子相關(guān)通路、炎癥感染相關(guān)通路及細胞調(diào)控相關(guān)通路。如在AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications中衰老和氧化作產(chǎn)生AGEs，AGEs作用于模式識別受體RAGE(免疫球蛋白超家族)AGE/RAGE信號可激活涉及NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPK的多種細胞內(nèi)信號通路，進而導(dǎo)致NF-kappaB活性。NF-kappa B促進IL-1、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子和VCAM-1、組織因子、VEGF、RAGE等多種炎性基因的表達。此外，JAK-STAT介導(dǎo)的和PI3K-Akt依賴的途徑是通過RAGE誘導(dǎo)的，RAGE又分別參與細胞增殖和凋亡[17]。而Apoptosis是典型的調(diào)節(jié)細胞凋亡的通路，通常細胞凋亡是一個通過激活半胱氨酸蛋白酶(天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶)消除受損或多余細胞的基因程序化過程。細胞凋亡的發(fā)生受許多相互關(guān)聯(lián)的過程控制，多種外源性化合物刺激位于細胞表面的腫瘤壞死因子(TNF)受體亞家族成員，后分別通過其特定的配體，如TNF-α、FasL或TRAIL等可導(dǎo)致細胞凋亡?；蛴捎诩毎麅?nèi)環(huán)境的改變導(dǎo)致DNA損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、代謝應(yīng)激或生長因子剝奪導(dǎo)致細胞色素c的釋放，激活caspase家族成員(如caspase-3和caspase-7)分泌增多，導(dǎo)致細胞死亡[18]。因此獨活寄生湯治療KOA可能通過調(diào)控 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway等信號通路，促使促凋亡和抗凋亡信號之間的平衡，減少炎癥細胞因子的分泌，延緩或改善關(guān)節(jié)軟骨的退變。

3.5 展望與不足本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和整合生物信息學(xué)方法，對獨活寄生湯治療KOA的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制進行探析。從獨活寄生湯中共獲得有效生物活性成分154種，活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)中，degree值較高槲皮素、漢黃連素、黃芩素、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、異鼠李素、山奈酚，可能在獨活寄生湯的藥理作用過程中發(fā)揮重要作用。預(yù)測的63個蛋白中可作為KOA核心治療靶點的有IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC等。這些靶點主要包含炎性細胞因子的調(diào)控和骨與軟骨細胞的代謝等生物學(xué)過程，涉及到炎性細胞因子的調(diào)控和骨與軟骨細胞的代謝等過程的有AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、TNF signaling pathway 等多條信號通路。這均證實了獨活寄生湯能夠多成分、多途徑、多靶點的調(diào)控KOA的發(fā)展進程，這也為證實中藥治療疾病的科學(xué)規(guī)范化提供了新的思路。