程珍珍，周本宏，姜 珊，李曠宇，金 丹

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072)

沒食子酸(Gallic acid)是石榴皮中可水解鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物，是石榴皮中沒食子苷的重要生物活性成分之一。已有大量研究表明，沒食子酸具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎、心臟保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)等作用[1-5]。原位單向腸灌流是研究藥物在腸道不同區(qū)域的通透性和腸道吸收機(jī)制最常用的方法[6-7]。本研究采用原位單向腸灌流模型，研究沒食子酸在大鼠各腸段的吸收特性。同時(shí)考察不同腸段、藥物濃度、時(shí)間、pH值、P-gp、MRP2對(duì)藥物吸收的影響。為提高鞣質(zhì)類成分口服制劑的生物利用度提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼斯特，16022801，純度99%)；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁，P111269，純度≥98%)；鹽酸維拉帕米(阿拉丁，K1629079)；吲哚美辛(阿拉丁，C1723020);甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器BT1-200恒流泵(上海琪特分析儀器有限公司)；HX1002T電子天平(武漢世紀(jì)超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；分析天平(德國Sartorius)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；LGC-1025M柱溫箱(荊州市津?；た萍加邢薰?；色譜柱(英國Fortis)；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，合格證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng) 1 周。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1Krebs-Ringer’s溶液的配制 稱取NaCl 7.8 g、NaHCO31.37 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、MgCl20.02 g、NaH2PO40.32 g、葡萄糖1.40 g，加水定容至1 000 mL，即得(pH 7.4)。

2.1.2對(duì)照品溶液的配制 取2.00 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，用甲醇溶解后，于25 mL棕色容量瓶中定容，并作為母液貯存于4 ℃冰箱。

2.1.3內(nèi)標(biāo)溶液的配制 本實(shí)驗(yàn)選用葛根素為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度為100 mg·L-1的溶液于10 mL容量瓶中，貯存于4 ℃環(huán)境中備用。

2.1.4供試品溶液的配制 精密稱定沒食子酸適量，用空白腸循環(huán)液溶解并稀釋成含沒食子酸質(zhì)量濃度分別為 20、40、80 mg·L-1的溶液，即得。

2.2 沒食子酸的定量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱為C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相，有機(jī)相乙腈(A)，水相三氟乙酸(B)，洗脫條件如下：0-8min，B 98%-78% 梯度洗脫，8-15min，B為78% 等度洗脫；流速1.00 mL·min-1；檢測(cè)波長254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對(duì)照品母液0.625 mL、1.250 mL、2.500 mL、3.750 mL、5.625 mL、10.000 mL，加溶劑定容于10.00 mL棕色容量瓶中。每個(gè)濃度對(duì)照品按照“2.2.1項(xiàng)”色譜條件下實(shí)驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣3次，得出峰面積值，以對(duì)照品濃度x軸，對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比值y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出曲線公式：y=0.307 4 x+0.648 1，R2=0.999 5，沒食子酸在5.00-80.00 mg·L-1呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3精密度考察 日內(nèi)精密度考察：取“2.1.2項(xiàng)”條件下配制的對(duì)照品母液，稀釋高、中、低3個(gè)不同濃度，按照“2.2.1項(xiàng)”色譜條件每隔2 h進(jìn)樣1次，相同方法進(jìn)樣5次，求出峰面積的RSD值。日間精密度：按照日內(nèi)精密度的測(cè)定方法，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算每日峰面積平均值的RSD值。結(jié)果顯示高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度各指標(biāo)成分峰面積RSD值均小于3%，表明該方法精密度良好。

2.2.4穩(wěn)定性考察 按照“2.1.2項(xiàng)”方法平行配制樣品3份，取5.00 mL，加腸灌流液定容至10.00 mL于棕色容量瓶中，進(jìn)行預(yù)處理后從0 min開始進(jìn)樣，后第30 min、第60 min、第90 min、第120 min、第150 min分別進(jìn)樣，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的峰面積與初始時(shí)間峰面積做對(duì)比。結(jié)果表明，沒食子酸在腸灌流液中的穩(wěn)定性符合要求，滿足測(cè)定要求。

2.2.5專屬性考察 分別取大鼠空白腸灌流液、空白腸灌流液加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)、沒食子酸腸灌流液，預(yù)處理后按照“2.2.1項(xiàng)”色譜下條件進(jìn)樣分析，得到灌流液中沒食子酸色譜圖。結(jié)果顯示沒食子酸峰形良好，與內(nèi)標(biāo)物分離完全。內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)藥物測(cè)定的影響忽略不計(jì)，該方法具有較好的專屬性。

2.2.6回收率考察 取采集后的高、中、低3個(gè)不同濃度的腸灌流液，加入已知濃度的對(duì)照品溶液，按照“2.2.1項(xiàng)”色譜下條件下進(jìn)樣分析，得到峰面積，按照公式：回收率/%=(加入標(biāo)準(zhǔn)樣品量-樣品含量)/加入標(biāo)準(zhǔn)樣品量×100%進(jìn)行計(jì)算，得到不同濃度樣品的加樣回收率。結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.3 大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)[8]取已禁食12 h(不禁水)健康SD大鼠，大鼠腹腔注射水合氯醛300 mg·kg-1麻醉后，固定，沿腹中線剪開小口，將大鼠腸道暴露，小腸兩端插管并結(jié)扎。用預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水排凈腸道內(nèi)容物，換成空白K-R液，平衡15 min，再更換為含藥腸灌流液將管道飽和15 min，直至出液口溶液與進(jìn)液口溶液中藥物的質(zhì)量濃度相等，消除實(shí)驗(yàn)過程中腸道對(duì)藥物的吸附作用。降低灌流體積流量0.20 mL·min-1，每15 min更換1次灌流液和收集瓶，實(shí)驗(yàn)持續(xù)90 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠處死，剪下灌流腸段，在37 ℃生理鹽水浸潤下剪開腸段，測(cè)量其長度(l)和橫截面半徑(r)。

2.4 腸吸收參數(shù)計(jì)算在體單向腸灌流模型用重量法對(duì)灌流液的流入和流出的體積進(jìn)行校正，消除其體積變化的影響[9]。吸收率常數(shù)(Ka)和有效表觀滲透率系數(shù)(Peff)的計(jì)算公式如下:

Ka=(1-CoutQout/CinQin)Q/πr2l

Peff=[Q×ln (CoutQout/CinQin)]/2πrl

其中，Qin和Qout分別為腸段灌入的灌流液和收集液的體積(mL，假定灌流液和收集液的質(zhì)量濃度為1.0 kg·L-1)，Q為灌流體積流量(0.20 mL·min-1)，Cin 和Cout分別為灌流液和收集液的藥液質(zhì)量濃度(mg·L-1)，l和r分別為被測(cè)段的長度(cm)和半徑(cm)。

3 結(jié)果

3.1 不同腸段對(duì)藥物吸收的影響取沒食子酸質(zhì)量濃度為40 mg·L-1的供試液，按“2.3”項(xiàng)操作，考察藥物在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸4個(gè)腸段的吸收情況。計(jì)算Ka和Peff值，結(jié)果見Tab 1。結(jié)果表明，沒食子酸在不同腸段均有吸收，其在不同腸段的Ka大小順序是空腸>十二指腸>回腸≈結(jié)腸。除空腸與結(jié)腸(Ka、Peff值比較)之間無差異外，其他各組之間差異有顯著性(P<0.05)。腸道上端沒食子酸的吸收優(yōu)于腸道下端的吸收。

Tab 1 Absorption of gallic acid at various segments in intestine of rats n=5)

3.2 不同藥物質(zhì)量濃度對(duì)腸吸收的影響以空腸為考察腸段，取質(zhì)量濃度為20、40、80 mg·L-1的供試液，按“2.3”項(xiàng)下的方法操作，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察藥物質(zhì)量濃度對(duì)吸收的影響。計(jì)算Ka、Peff 值，結(jié)果見Tab 2。不同質(zhì)量濃度下沒食子酸大鼠空腸吸收參數(shù)差異沒有顯著性(P>0.05)，提示沒食子酸在小腸的吸收沒有濃度依賴性，吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。

Tab 2 Effect of drug concentration on Ka and Peff of gallic acid n=5)

3.3 不同pH值對(duì)腸吸收的影響分別用稀HCl和稀NaOH溶液調(diào)節(jié)K-R緩沖液pH值為5.4和6.8，配制不同pH值的灌流液(沒食子酸40 mg·L-1)，考察 pH 值對(duì)藥物吸收的影響。結(jié)果如Tab 3所示，當(dāng)介質(zhì)pH 值升高時(shí)，沒食子酸在空腸的Ka、Peff 值明顯降低(P<0.05)。

Tab 3 Effect of pH value on Ka and Peff of

3.4 P-gp對(duì)腸吸收的影響按“2.3”項(xiàng)下的方法操作，以空腸為考察腸段，考察 P-gp 抑制劑對(duì)藥物吸收的影響。計(jì)算Ka和Peff，結(jié)果如Tab 4所示，加入維拉帕米(P-gp抑制劑)后，沒食子酸吸收增加(P<0.05)，表明沒食子酸可能是P-gp底物。沒食子酸的吸收受到P-gp外排作用的影響。

Tab 4 Effect of P-gp on Ka and Peff of gallic acid n=5)

3.5 MRP2對(duì)腸吸收的影響按“2.3”項(xiàng)下的方法操作，以空腸為考察腸段，考察MRP2抑制劑對(duì)藥物吸收的影響。計(jì)算Ka和Peff，結(jié)果如Tab 5所示，加入吲哚美辛(MRP2抑制劑)后，沒食子酸吸收增加(P<0.05)，表明沒食子酸可能是MRP2底物。

Tab 5 Effect of MRP2 on Ka and Peff of gallic acid n=5)

4 討論

腸道吸收對(duì)口服藥物的生物利用度起著至關(guān)重要的作用。在腸道中，有許多參與藥物藥代動(dòng)力學(xué)過程的運(yùn)輸?shù)鞍?。因此，研究其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對(duì)提高其有效性和安全性具有重要意義[10]。

近年來，國內(nèi)外對(duì)沒食子酸的藥理活性研究很多，然而對(duì)其腸吸收的機(jī)制研究相對(duì)較少。我們之前的研究闡述了沒食子酸在Caco-2細(xì)胞單分子膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收特性[11]。然而，目前為止，利用原位單向腸灌流法研究沒食子酸在腸道中的吸收還沒有被報(bào)道，沒食子酸的吸收機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究采用原位單向腸灌流模型，進(jìn)一步探究不同濃度沒食子酸在小腸不同腸段的腸道吸收機(jī)制以及影響腸道吸收的因素。

在單向腸灌流中可以看出，隨著沒食子酸濃度的增加，腸道中的Peff值無明顯差異，說明沒食子酸在腸道的吸收方式主要是被動(dòng)擴(kuò)散。對(duì)于被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，不存在飽和，藥物可以沿濃度梯度在沒有ATP的情況下跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，包括載體轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)文獻(xiàn)，當(dāng)Peff值<3×10-6cm·s-1時(shí)，說明藥物吸收不良，當(dāng)Peff值>2×10-5cm·s-1時(shí)，藥物吸收良好[12]。在我們的研究中，沒食子酸在4個(gè)腸段中的Peff值均>2×10-5cm·s-1。因此，沒食子酸在腸內(nèi)吸收良好。沒食子酸在小腸上端的吸收好于小腸下端的吸收?？赡茉蚴遣煌c段存在生理差異，包括膜成分、粘膜厚度、酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)數(shù)量和能力等[13]。在酸性條件下，沒食子酸的吸收較好?？赡苁怯捎跊]食子酸呈酸性，所以在酸性條件下它可能能夠被更好地吸收。

P-糖蛋白(P-gp)和多藥耐藥相關(guān)蛋白-2(MRP2)主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜上，是影響藥物在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[14]。我們的研究表明，維拉帕米(P-糖蛋白抑制劑)和吲哚美辛(MRP2抑制劑)顯著增加空腸沒食子酸的有效表觀滲透率系數(shù)值，說明腸道對(duì)沒食子酸的吸收受到外排轉(zhuǎn)運(yùn)體(P-gp、MRP2)的影響。

綜上，沒食子酸的吸收機(jī)制可能是被動(dòng)擴(kuò)散，沒食子酸在小腸內(nèi)吸收良好。細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)通路和外排轉(zhuǎn)運(yùn)體也參與了沒食子酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。P-gp和MRP2可能參與沒食子酸的腸道吸收。此外，沒食子酸在全腸段都能吸收，腸道上端沒食子酸的吸收優(yōu)于腸道下端的吸收。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠在體單向腸灌流模型，闡明了沒食子酸在腸道中的吸收特性。對(duì)于進(jìn)一步研究鞣質(zhì)類成分的作用機(jī)制、提高生物利用度、指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。