王琪珊，范凱健,2，許冰馨，滕 輝，陳斯佳，王婷玉

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011；2.上海市崇明區(qū)精神衛(wèi)生中心藥劑科，上海 202150)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫系統(tǒng)疾病,免疫系統(tǒng)的紊亂被認為是導致RA發(fā)病的主要原因。脾臟作為人體內(nèi)最為重要的免疫器官，同時也是人體內(nèi)淋巴細胞聚集的場所。T淋巴細胞主要分為輔助性T淋巴細胞(T helper cells，Th)和抑制性T淋巴細胞(suppressor T cells，Ts)，其平衡的失調(diào)會導致免疫性疾病的產(chǎn)生。T淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用主要通過其分泌的細胞因子來實現(xiàn)，而有些細胞因子具有很強的促炎功能并能加劇RA的病程進展。RA的主要特征也包括關節(jié)炎癥和軟骨破壞。關節(jié)的慢性炎癥狀態(tài)會導致成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)的激活和廣泛介質的釋放，而這些介質又作用于免疫細胞和軟骨細胞，從而加劇炎癥反應和軟骨損傷[1]。

糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)在RA的治療中起著不可替代的作用，因為它們可以快速緩解關節(jié)腫脹和關節(jié)損傷[2]。但是，由于GCs的多靶點作用，在全身給藥后已報道了多種不良反應，例如體質量減輕和高血糖。因此，迫切需要提高GCs治療的安全性。為了更加安全有效地使用GCs，研究人員開始開發(fā)針對GCs修飾的藥物。藥物傳遞系統(tǒng)(drug delivery systems，DDS)可以在預定的時間或所需的特定位置以預定的速率傳遞藥物來實現(xiàn)更好的治療效果并克服常規(guī)藥物制劑的不足。作為先進的DDS，可注射的溫敏水凝膠起著非常重要的作用[3]。以體內(nèi)注射的方式，水凝膠在正常人體溫度下變?yōu)榘牍腆w的凝膠。將地塞米松摻入水凝膠后，該系統(tǒng)將能充當體內(nèi)持續(xù)的地塞米松釋放庫[4]?？勺⑸涞臏孛裟z系統(tǒng)擁有多種優(yōu)點，例如疏水性藥物的溶解度提高、安全性提高、位點特異性遞送。因此，在可注射的溫敏凝膠的輔助下，原位給藥是局部給藥的有效途徑。本研究將通過觀察膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠關節(jié)腔內(nèi)注射地塞米松溫敏凝膠(dexamethasone-loaded thermosensitive hydrogel，DLTH)后免疫功能和軟骨降解的變化，以確定DLTH治療RA的潛能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6-8周齡SPF級雄性Wistar大鼠(體質量：200-250 g)30只，由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物房所提供[SYXK(滬)2016-0016]。常規(guī)飼養(yǎng)于擁有獨立通氣籠盒(individual ventilated cages，IVC)的動物房，12 h光照和夜循環(huán)，溫度(22±2)℃，濕度50%-60%。

1.2 主要試劑與儀器牛Ⅱ型膠原(Chondrex公司，批號170376)、弗氏不完全佐劑(Chondrex公司,170594)、地塞米松(Stemcell Technologies,批號BX27114)、TRIzol(美國Ambion公司，批號184608)。PCR引物(上海生工生物科技有限公司)、PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)、動物脾臟組織淋巴細胞分離液(天津灝洋華科生物科技有限公司)。7500實時定量PCR儀為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品,酶標儀為美國Bio Tek公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1地塞米松溫敏凝膠的制備 將殼聚糖溶解在1%的醋酸溶液中制備成2%的溶液。加入一定量的甘油和地塞米松藥物溶液，并在攪拌中滴入硼砂溶液，最后在pH=7的條件下獲得地塞米松濃度為2.5 g·L-1的新型DLTH。凝膠在室溫為流動液體，在37 ℃時為半固態(tài)水凝膠狀態(tài)(Fig 1)。

Fig 1 Morphology of hydrogel at different conditionsA.At room temperature;B.At 37 ℃

1.3.2CIA模型的建立與給藥 d 0的時候，將牛Ⅱ型膠原與弗氏不完全佐劑按1 ∶1混勻成乳劑后環(huán)繞大鼠尾根部進行注射。d 7時，以同樣方式注射于大鼠尾根部。將造模成功的大鼠隨機分為模型組和DLTH組，同時設置對照組。從d 12起，DLTH組大鼠雙側膝關節(jié)內(nèi)各注射40 μL DLTH(即1 mg·kg-1地塞米松)，每周2次，連續(xù)3周。對照組和模型組注射等量生理鹽水。

1.3.3ELISA檢測細胞因子白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達 在實驗結束時，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)麻醉所有大鼠。從麻醉大鼠眼睛的內(nèi)眥靜脈收集血液。將血液在4 ℃下以3 600 r·min-1離心10 min后獲得血清。根據(jù)說明書，使用ELISA試劑盒測量血清中的細胞因子(TNF-α、IL-1β)水平。

1.3.4脾臟淋巴細胞的提取和病理學觀察 給藥結束后，眼周取血后處死大鼠，取出脾臟，將脾臟組織一半固定于4%的多聚甲醛中，一半取大鼠的脾淋巴細胞。將3組大鼠的脾臟，研磨、過濾、離心后加紅細胞裂解液，去除紅細胞后，可獲得脾臟組織單細胞懸液。根據(jù)說明書，取等量的脾臟組織單細胞懸液加于淋巴細胞分離液液面上，500×g離心30 min。離心后，用吸管吸取環(huán)狀乳白色淋巴細胞層，并加清洗液再次離心清洗細胞，得到脾臟淋巴細胞。將大鼠的脾臟組織進行石蠟包埋和病理切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)后，用顯微鏡觀察病理改變。根據(jù)生發(fā)中心，動脈周圍淋巴鞘(periarterial lymphatic sheath，PALS) 的細胞密度、邊緣區(qū)來進行評分:0分為正常;1分為輕度;2分為中度;3分為重度;4分為極重。

1.3.5膝關節(jié)的組織病理學分析 分離后肢，將其置于4%多聚甲醛中24 h，然后用0.5 mol·L-1EDTA脫鈣并包埋在石蠟中。制備5 μm厚的石蠟切片，然后用二甲苯脫蠟，用乙醇梯度脫水，最后進行甲苯胺藍染色，通過甲苯胺藍染色分析膝關節(jié)中的軟骨降解情況。

1.3.6膝關節(jié)的免疫組化分析 將切片在二甲苯中脫蠟，并用梯度乙醇水化。添加蛋白酶K消化緩沖液以修復抗原，并添加3%過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。用5%的BSA封閉，然后將它們與一抗(基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、MMP-13，聚集蛋白聚糖酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5，ADAMTS-5)在4 ℃孵育過夜。洗滌一抗，并與二抗在室溫下孵育30 min，然后添加DBA進行顯色。用Mayer蘇木精復染后封片。由兩名獨立的觀察員評估關節(jié)軟骨中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5的表達水平。

1.3.7PCR檢測相關細胞因子的表達情況 分離對照組、模型組和給藥組大鼠脾淋巴細胞和軟骨組織進行PCR檢測。使用TRIzol試劑提取總RNA，并測量其濃度和純度。根據(jù)標準程序使用cDNA反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR引物由上海生工生物有限公司合成。引物見Tab 1。

2 結果

2.1 DLTH對CIA大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量的影響與對照組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α的表達量明顯升高。在給予DLTH治療后，這些炎癥因子的表達都明顯降低，見Fig 2。

Fig 2 Effects of IL-1β and TNF-α **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

2.2 DLTH對CIA模型脾臟病理的影響與對照組相比，CIA大鼠脾臟結構出現(xiàn)嚴重的變形，白髓增殖明顯，纖維囊變薄，并且有大量生發(fā)中心形成。在給予DLTH治療后，脾臟結構病理性變化明顯改善，見Fig 3。

2.3 DLTH對CIA大鼠脾淋巴細胞中炎癥因子的影響相較對照組，模型組脾淋巴細胞中，TNF-α mRNA的表達量明顯升高。在給予DLTH治療后，其表達量明顯降低。與對照組相比，模型組中Th1細胞相關的IL-2、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)，Th2細胞相關的IL-4、IL-5，及Th17 細胞相關的IL-17a的基因表達量明顯增加，而Treg相關的細胞因子IL-10和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)基因表達量顯著降低。DLTH膝關節(jié)給藥后，以上炎癥狀態(tài)可明顯被逆轉，見Fig 4。

2.4 DLTH對CIA大鼠脾淋巴細胞中特異性轉錄因子的影響T-bet，RORγT、GATA3和Foxp3是Th1、Th17、Th2和Treg的特異性轉錄因子。T-bet、RORγT的基因分別是Tbx21、RORc。與對照組相比，模型組中脾淋巴細胞中Tbx21、RORc的mRNA表達升高，GATA3、Foxp3的mRNA表達下降。在給予DLTH治療后，Tbx21、RORc的mRNA表達下降，GATA3、Foxp3的mRNA表達上升，差異均具有統(tǒng)計學意義。與對照組相比，模型組Tbx21/GATA3、RORc/Foxp3升高，給藥后比值降低，見Fig 5。

2.5 DLTH對CIA大鼠膝關節(jié)軟骨的影響大鼠膝關節(jié)甲苯胺藍染色病理學分析表明，與對照組大鼠相比，CIA大鼠膝關節(jié)軟骨層軟骨降解明顯，DLTH給藥后可以明顯改善嚴重的軟骨損傷，見Fig 6。

2.6 DLTH對CIA大鼠軟骨中相關酶表達的影響MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5是在軟骨降解起重要作用的酶。與對照組相比，CIA大鼠軟骨層MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5的表達明顯升高。在給予DLTH治療后，MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5的表達都明顯降低，見Fig 7。

2.7 DLTH對CIA大鼠軟骨中炎癥因子和基質金屬蛋白酶基因表達的影響與對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α mRNA的表達量明顯升高。在給予DLTH治療后，這些炎癥因子的表達量均明顯降低。與對照組相比，CIA大鼠軟骨中MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5的mRNA表達顯著升高。在給予DLTH治療后，這些軟骨相關降解基因的表達都顯著降低，見Fig 8。

Fig 3 The pathological changes of spleen The yellow arrows indicate white pulp and the green arrows indicate germinal Scale bar=100 μm.**P<0.01 vs control group;#P<0.01 vs model group.

Fig 4 Expression of splenic lymphocyte *P<0.05,**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

Fig 5 Expression of splenic lymphocyte specific transcription *P<0.05,**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

Fig 6 Histological changes of knee **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.Scale bar=100 μm.

Fig 7 Effects of related enzyme expression in Red arrows indicate positive cells.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.Scale bar=100 μm.

Fig 8 Effects of inflammatory and matrix metalloproteinase genes expression in **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

3 討論

RA是一種自身免疫性疾病，其主要特征是炎癥引起的關節(jié)破壞。雖然目前尚無治愈 RA 的方法，但已經(jīng)有多種藥物可以用來減緩疾病發(fā)展的進程。目前臨床上應用比較多的藥物包括非甾體類抗炎藥、糖皮質激素和抗風濕藥物。糖皮質激素類藥物雖然已被證明具有緩解疼痛的作用，但不能緩解疾病進展，且伴隨的不良反應也令人不安。殼聚糖是一種天然多糖，具有生物相容性、生物降解性、無毒、生理惰性，并且對蛋白質有顯著親和力、耐細菌、止血等許多特性。由于其良好的生物相容性，殼聚糖被廣泛用于制備微球制劑[5-6]。殼聚糖基材常用于藥物遞送領域，作為藥物可持續(xù)釋放的基材。特別是含有多種多元醇(如甘油、乙二醇和山梨醇)的殼聚糖，由于它們能夠在特定靶點持續(xù)釋放特定的藥物，可作為注射性的凝膠，因此備受關注。這些多元醇可使殼聚糖保持液態(tài)，在酸性溶液中，多元醇在殼聚糖周圍形成水的屏障，并在較高的pH值和較低的溫度下保持殼聚糖的溶解度[7]。近年來，有研究報道，殼聚糖、高甘油鈉或甘油和飽和硼砂溶液混合制備可形成溫敏水凝膠[8]。因此，在溫敏殼聚糖基材的凝膠載體研究中，甘油也受到了廣泛的關注。硼砂常常被用作該溫敏水凝膠體系的pH調(diào)節(jié)劑[9]。因此，我們選擇殼聚糖-甘油-硼砂作為地塞米松的載體。殼聚糖-甘油-硼砂原位凝膠是一種優(yōu)良的局部給藥系統(tǒng)，是一種可注射的微創(chuàng)溶液，在局部給藥后會隨溫度變化而變成半固態(tài)凝膠。DLTH通過直接注射到關節(jié)腔室，不僅能達到在關節(jié)處富集藥物，降低全身毒性的作用，還能延長藥物釋放時間，提高地塞米松的治療指數(shù)，降低不良反應風險。因此，本研究將探索地塞米松溫敏凝膠關節(jié)腔內(nèi)注射治療后對RA的免疫調(diào)節(jié)和軟骨保護作用。

RA起病的主要原因包括自身抗體形成，激活T細胞和B細胞，釋放大量炎癥因子，包括IL-1β、TNF-α。IL-1β、TNF-α參與全身炎癥反應，導致關節(jié)組織破壞。并且，TNF-α的釋放，可使巨噬細胞與促炎因子結合，進一步加重全身炎癥。實驗中，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平升高，DLTH給藥后明顯降低血清IL-1β、TNF-α含量，提示DLTH可改善RA全身炎癥反應。脾臟是機體最為重要的免疫器官之一，可以準確反映機體的免疫情況。在實驗中，對照組大鼠的脾臟病理切片顯示，白髓和紅髓界限分明，且被厚的纖維囊所包裹。而CIA大鼠的脾組織結構出現(xiàn)明顯的扭曲且纖維囊變薄，大量生發(fā)中心形成。在給予 DLTH治療后，脾臟病理性結構變化得到顯著改善。脾臟在調(diào)節(jié)機體免疫的時候，還會通過調(diào)節(jié)Th細胞來調(diào)節(jié)機體免疫反應。作為CD4+Th細胞的四個重要亞型，Th1、Th2、Th17和Treg細胞與RA顯著相關。RA患者的Th1/Th2比值增加，并且與疾病活動呈正相關[10]。RA疾病可能還會損害以Th17/Treg比值低為特征的Th17與Treg之間的平衡。因此，調(diào)節(jié)Th1/Th2和Th17/Treg失衡狀態(tài)有利于治療RA。本次研究發(fā)現(xiàn)DLTH可能通過抑制大鼠T細胞向Th1和Th17分化來調(diào)整Th1/Th2、Th17/Treg失衡狀態(tài),最終改變CIA大鼠免疫應答紊亂狀態(tài)。

RA中免疫紊亂會導致炎癥反應、軟骨破壞等。炎性細胞因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17a，在關節(jié)炎中起非常重要的作用[11-12]。這些細胞因子表達的升高會刺激軟骨或滑膜內(nèi)的炎癥細胞產(chǎn)生MMPs和ADAMTS。關節(jié)軟骨主要是由軟骨細胞和細胞外基質(extracellular matrix,ECM) 組成，ECM主要是由組織液、膠原蛋白和蛋白多糖所組成。MMPs 是一類在ECM的降解過程中占據(jù)重要地位的蛋白酶超家族。MMPs 的表達增加與 RA 疾病的進展有顯著的相關性。在各種MMPs中，MMP-3、MMP-9和MMP-13對膠原蛋白的降解最為重要。Tuncer等[13]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者的血清中MMP-3的表達水平顯著高于對照組，且軟骨破壞嚴重。MacLauchlan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9表達的升高會增強破骨細胞的活性和形成從而導致軟骨破壞。MMP-13過表達的轉基因小鼠發(fā)生自發(fā)性的關節(jié)內(nèi)軟骨破壞，而MMP-13敲除小鼠會在軟骨內(nèi)骨化表現(xiàn)出明顯的障礙[15]。ADAMTS是一種聚集蛋白聚糖酶，在軟骨ECM的分解代謝中起著重要的作用[16]。ADAMTS的家族成員眾多，其中ADAMTS-4和ADAMTS-5跟關節(jié)軟骨密切相關。Liacini等[17]研究發(fā)現(xiàn)，中藥雷公藤F(tripterygium wilfordii Hook F，TWHF)可以抑制軟骨細胞中 ADAMTS-4 的表達從而具有軟骨保護作用。Glasson等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-5的缺失會抑制關節(jié)炎模型中的軟骨損傷。在本次研究中，CIA大鼠軟骨破壞嚴重，且軟骨細胞中炎癥因子(IL-6、IL-17a、TNF-α、IL-1β)和降解酶(MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5)表達增加。在給予DLTH治療后，軟骨破壞現(xiàn)象明顯減輕，且炎癥因子和降解酶表達顯著降低。

綜上，通過體內(nèi)研究證明DLTH對RA具有明顯的免疫調(diào)節(jié)和軟骨保護作用。因此，DLTH作為地塞米松的新劑型，可能為治療RA提供一種更為有效和安全的方法。