徐 瑞，顧靜怡，劉思琪，段 薇，黃 云，呂 盈，徐 崢，張琴琴，魏 昕

牙髓病和根尖周病一般來源于根管內(nèi)微生物的感染，根管內(nèi)微生物以生物膜形式存在[1]。無論是根管預(yù)備還是根管充填，其目的都是為了消除根管內(nèi)微生物的感染。糞腸球菌是一種革蘭陽性兼性厭氧菌，作為牙髓感染的常見細(xì)菌，可在感染的牙髓中，持續(xù)性根尖周炎、再次感染的根管中檢測出來[2-5]。糞腸球菌即使在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下，仍然可以形成生物膜[6]。白念珠菌與口腔內(nèi)微生物存在交互作用，白念珠菌也可以在感染根管中檢測出來[7]，研究表明，在外傷或術(shù)后的感染創(chuàng)口中可以檢測到糞腸球菌和白念珠菌[8-9]，白念珠菌和糞腸球菌可混合存在于根管內(nèi)，兩種微生物混合形成的生物膜定植于根管內(nèi)，徹底清除十分困難。微生物生物膜的存在將導(dǎo)致感染的持續(xù)，降低根管機械和化學(xué)預(yù)備的效果，導(dǎo)致根管治療失敗，根尖周組織損傷難以愈合[10]。體外白念珠菌和糞腸球菌的混合生物膜較單物種生物膜可以更好地模擬根管內(nèi)或傷口的感染，而且關(guān)于糞腸球菌和白念珠菌雙菌種的混合生物膜的研究較少。

臨床上，采用機械預(yù)備配合化學(xué)消毒可以有效清除微生物，其中次氯酸鈉以其高效的殺菌、溶解有機組織等性能，作為根管沖洗的藥物已經(jīng)得到廣泛的研究[11-12]，但是次氯酸鈉也有較高的毒性，其細(xì)胞毒性隨著時間及濃度的增加而增強[13]，對根尖周組織存在一定的刺激[14]?？咕幬飳S腸球菌和白念珠菌等微生物感染傷口的抗菌作用的研究已有相關(guān)報道[15-16]，這些藥物具有一定的抗菌作用，但其效率仍有一定的局限性。法尼醇作為一種抗微生物的化學(xué)分子，對白念珠菌生物膜形成存在抑制作用[17]。法尼醇對變形鏈球菌和糞腸球菌也有一定的殺菌作用[18-21]。不同濃度的法尼醇對于白念珠菌和糞腸球菌雙物種混合生物膜的抑制作用的效果國內(nèi)外尚罕見報道。本研究探討法尼醇對白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株(SC5314)由上海第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院遺傳工程國家重點實驗室饋贈。糞腸球菌(ATCC29212)由江蘇省口腔疾病研究重點實驗室提供。法尼醇(Sigma，美國)；3，3′-[1-(苯氨?；?-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉(XTT)和甲萘醌(Sigma，美國)；沙堡瓊脂培養(yǎng)基(Sabourd’s dextroseagar, SDA)(63.0 g/L) ，腦心浸腦液肉湯培養(yǎng)基(BHI，OXOID，英國)；YPD培養(yǎng)液(2%葡萄糖，2%胰蛋白胨，1%酵母提取物)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO，美國)。96孔培養(yǎng)皿(Corning，美國)；麥?zhǔn)媳葷醿x(WGZ-2XJ，中國上海昕瑞儀器儀表有限公司)；YCP系列二氧化碳培養(yǎng)箱(上海易亮醫(yī)療器械有限公司)；0.22 μm針孔式濾膜過濾器(Millipore，美國)；倒置顯微鏡(Olympus，日本)；低溫高速離心機(Eppendorf，德國)；M2多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)；LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Counting 試劑盒(Life technologies，美國)；激光共聚焦掃描顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 白念珠菌菌懸液的配制 將-80 ℃保存的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株(SC5314)接種到SDA培養(yǎng)基上生長，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。取單克隆菌株于YPD培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min搖床過夜，達(dá)到對數(shù)生長期，2 100×g離心10 min，收集YPD培養(yǎng)液中對數(shù)生長狀態(tài)的真菌，無菌PBS洗滌2次，細(xì)胞重新懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)液中，血細(xì)胞計數(shù)法制備成密度為1×106個/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液。

1.2.2 糞腸球菌菌懸液的配制 將-80 ℃保存的糞腸球菌(ATCC29212)接種到BHI培養(yǎng)基上生長，37 ℃培養(yǎng)24 h。取單克隆菌株于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖床生長3～5 h，達(dá)對數(shù)生長期，16 000×g離心5 min，收集BHI液體培養(yǎng)基中對數(shù)生長狀態(tài)的細(xì)菌，無菌PBS洗滌2次，細(xì)菌重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中，麥?zhǔn)媳葷醿x計數(shù)，制備成密度為1×106個/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液。

1.2.3 白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜的制備 分別將100 μL的1×106個/mL的白念珠菌和糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌懸液以1∶1的比例接種于96孔微量培養(yǎng)板中[22]，37 ℃，5%CO2孵育2 h后，每孔200 μL PBS輕洗。RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h和48 h，移出培養(yǎng)液，輕輕沖洗培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下初步鑒定白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜的形成。

1.2.4 法尼醇抑制白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜活性的測定 按上述方法制備24 h和48 h生物膜后，分別用含不同濃度法尼醇(100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800 μmol/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h[23]。設(shè)立不含法尼醇陰性對照組及不含白念珠菌和糞腸球菌的空白對照組。采用PBS溶液將XTT配成0.5 mg/mL的溶液，0.22 μm濾膜過濾，分裝后-70 ℃避光保存[24]。甲萘醌用丙酮配成10 mmol/L的溶液分裝，-70 ℃避光保存。臨用前配制XTT/甲奈醌溶液，使甲萘醌終濃度為1 μmol/L，分別向各孔加入XTT/甲萘醌溶液100 μL，37 ℃避光反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，酶標(biāo)儀讀取各孔490 nm波長處的OD值。根據(jù)公式Y(jié)=[1-(OD實驗組-OD空白對照組)÷(OD陰性對照組-OD空白對照組)]×100%，計算每孔相對抑菌率(Y)，Y值越大，抑菌強度越大。抑制白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜50%活性的最低藥物濃度(sessile minimal inhibitory concentration 50%，SMIC50)為Y≥50%時的最低法尼醇濃度。實驗重復(fù)4次，每個濃度均設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察法尼醇對白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜的抑菌效果 取細(xì)胞爬片放入24孔板，按上述方法制備微生物懸液，以1∶1的比例，在24孔板中各加入500 μL白色念珠菌和500 μL糞腸球菌懸液，培養(yǎng)2 h后移出培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗去未粘附的微生物，加入1 mL 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)至24 h和48 h，形成生物膜。培養(yǎng)至所需時相后，24 h生物膜用150、400 μmol/L的法尼醇處理，48 h生物膜用200、500 μmol/L的法尼醇處理24 h。設(shè)立不含法尼醇的對照組。每個時相每個濃度各制備3個標(biāo)本，移出藥物及培養(yǎng)液，PBS洗滌后，保持生物膜表面無多余PBS，在生物膜表面滴加150 μL熒光染色液(按VSYTO-9∶VPI∶V蒸餾水=3∶3∶2000避光配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，室溫下暗室孵育15 min，PBS洗滌，去除多余PBS，進行CLSM觀察。觀察條件：SYTO-9的激光發(fā)射波長為488/525 nm，PI的激光發(fā)射波長為561/642 nm，放大200倍。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS25. 0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，各時相生物膜各濃度對應(yīng)的指標(biāo)均采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD法)，各濃度對應(yīng)的抑菌率采用重復(fù)測量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡下觀察微生物的生物膜形成

在倒置顯微鏡下，圖1可見酵母細(xì)胞與其出芽延伸所形成的菌絲密集交織，并沿著菌絲形成團塊狀聚集，糞腸球菌在菌絲中間聚集，白念珠菌菌絲與糞腸球菌的混合生物膜呈多層膜狀結(jié)構(gòu)，48 h混合生物膜較24 h時相的更為致密。

A：24 h；B：48 h

2.2 法尼醇對白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜結(jié)構(gòu)的激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

肉眼可見細(xì)胞爬片上的淺灰白色生物膜，激光共聚焦顯微鏡下，紅色的熒光為死的微生物，綠色的熒光為活的微生物，橘黃色的部分為活死微生物疊加顯示出的熒光顏色。白念珠菌菌絲呈細(xì)長的絲狀；糞腸球菌菌體直徑較小，生物膜狀態(tài)下活菌為一片的綠色熒光，死菌則為一片的紅色熒光。糞腸球菌和白念珠菌的混合生物膜不均質(zhì)，導(dǎo)致在激光共聚焦顯微鏡觀察時，顯微鏡下部分區(qū)域熒光強度較弱較暗，部分觀察區(qū)熒光強度較強較明亮。圖2可見150 μmol/L法尼醇處理24 h混合微生物膜，激光共聚焦顯微鏡下活死微生物的比例約為50.1%，400 μmol/L法尼醇處理24 h混合微生物膜，激光共聚焦顯微鏡下活死微生物的比例約為81.4%。圖3可見200 μmol/L法尼醇處理48 h混合微生物膜，激光共聚焦顯微鏡下活死微生物的比例約為50.7%，500 μmol/L法尼醇處理48 h混合微生物膜，激光共聚焦顯微鏡下活死微生物的比例約為81.6%。與XTT減低法檢測法尼醇對24、48 h時相混合微生物膜的抑制作用相吻合。

2.3 SMIC50檢測結(jié)果

法尼醇對24 h混合生物膜態(tài)白念珠菌和糞腸球菌的SMIC50值為150 μmol/L，對48 h混合生物膜態(tài)白念珠菌和糞腸球菌的SMIC50值為200 μmol/L。

2.4 不同濃度法尼醇的抑制效果

實驗組法尼醇對白念珠菌和糞腸球菌的混合生物膜有抑制作用，與陰性對照組(不含法尼醇)比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。圖4顯示法尼醇對白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜抑制強度與法尼醇濃度相關(guān)。隨著法尼醇濃度的升高，對混合生物膜的抑制作用呈上升趨勢，法尼醇濃度在100～300 μmol/L時，抑菌作用明顯，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。100 μmol/L的法尼醇處理混合生物膜時，對48 h的混合生物膜的抑制作用高于24 h時相的生物膜，具體原因有待進一步探究。24 h和48 h時相存在主效應(yīng)，各濃度存在主效應(yīng)，時相濃度存在交互作用。100～300 μmol/L、800 μmol/L法尼醇對24、48 h時相生物膜的抑菌作用存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，350～700 μmol/L的法尼醇對24、48 h時相生物膜的抑菌作用無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

A1：法尼醇未處理的混合生物膜；A2：法尼醇抑制混合生物膜50%活性；A3：法尼醇抑制混合生物膜80%活性；綠色熒光代表活菌，紅色熒光代表死菌，橙色熒光為活死菌重疊

B1：法尼醇未處理的混合生物膜；B2：法尼醇抑制混合生物膜50%活性；B3：法尼醇抑制混合生物膜80%活性；綠色熒光代表活菌，紅色熒光代表死菌，橙色熒光為活死菌重疊

圖4 不同濃度法尼醇對24、48 h白念珠菌和糞腸球菌混合生物被膜的影響Fig.4 Inhibitory effect of different concentrations of farnesol on mixed biofilms of Candida albicans and Enterococcus faecalis after 24 h and 48 h

3 討 論

許多微生物以生物膜形式存在，生物膜是一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。以生物膜形式存在的微生物對于抗菌藥物、宿主的免疫防御機制及外界壓力有著更高的抵抗力[25]。白念珠菌與厭氧菌形成混合生物膜時，白念珠菌形成的生物膜提供了低氧的微環(huán)境，即使在有氧的條件下培養(yǎng)，白念珠菌提供的低氧微環(huán)境也可以支持厭氧菌的生長[26]。這有利于兼性厭氧菌——糞腸球菌的生長。Cruz等[27]的研究表明，糞腸球菌對白念珠菌的主要影響在于抑制白念珠菌菌絲的形成。糞腸球菌對于白念珠菌菌絲的抑制，說明白念珠菌與糞腸球菌在生物膜內(nèi)可能存在拮抗作用。

本研究采用XTT減低法檢測法尼醇對糞腸球菌和白念珠菌混合生物膜的抑制作用。XTT是四唑氮衍生物，甲萘醌存在時，在活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶的作用下，XTT可被還原成可溶性的棕色產(chǎn)物，使得不同測試孔內(nèi)的溶液顏色產(chǎn)生差異，進一步通過酶標(biāo)儀測定溶液的OD值以精確反映細(xì)胞的代謝活性。該法是目前定量研究生物膜的常用的方法，具有敏感性好、準(zhǔn)確性好，數(shù)據(jù)穩(wěn)定等優(yōu)勢，相較于MTT法和菌落CFU計數(shù)法，該法更簡單且精確，再現(xiàn)性好[28-29]。同時，本研究增加了激光共聚焦顯微鏡觀察法尼醇對白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜的抑制作用。激光共聚焦顯微鏡可以在不破壞細(xì)胞或組織的狀態(tài)下，觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并對其進行實時的檢測，近年來逐漸用于檢測生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)或存活能力[30-31]。通過熒光染色，區(qū)分生物膜內(nèi)活死菌，更為直接地展現(xiàn)了生物膜內(nèi)細(xì)菌的生存狀態(tài)，輔助證實了法尼醇對混合生物膜的抑制作用。

抗生素的濫用導(dǎo)致微生物對抗生素的耐藥性增加，非抗生素類藥物的研究或許將更有利于微生物感染的控制。法尼醇(C15H2O6)是首次在真菌中發(fā)現(xiàn)的密度感應(yīng)分子，外源性的法尼醇作為一種抗微生物的化學(xué)分子，可以抑制多種微生物的生長[17-21]。法尼醇微溶于水，可以積聚在微生物的生物膜上，損害生物膜的完整性導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物的釋放[32-33]。有研究證明1%法尼醇對成纖維細(xì)胞的毒性小于1%次氯酸鈉[14]，表明法尼醇應(yīng)用于根管沖洗或控制創(chuàng)口感染有一定的優(yōu)勢。

本研究表明法尼醇對糞腸球菌和白念珠菌的混合生物膜有一定的抑制作用，可以抑制生物膜內(nèi)的微生物并呈劑量依賴性。100～300 μmol/L法尼醇對兩者混合生物膜抑制率的增長較明顯，隨著濃度的增加，抑制作用增長幅度逐漸減緩，抑制率趨于穩(wěn)定。本組的前期研究表明，法尼醇對24 h白念珠菌生物膜的SMIC50為200 μmol/L[34]，在此次實驗中，法尼醇對24 h白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜的SMIC50為150 μmol/L。最低抑菌濃度的降低，是否因為白念珠菌和糞腸球菌相互的拮抗作用，增加了白念珠菌的藥物敏感性，有待進一步研究。除法尼醇濃度為100 μmol/L以外的其他濃度作用時，相同濃度的法尼醇對48 h的生物膜的抑制率略低于24 h的微生物膜。法尼醇濃度為100 μmol/L時，對48 h的混合生物膜抑制作用強于24 h，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。Fox等[26]的研究表明多種細(xì)菌與白念珠菌混合培養(yǎng)形成生物膜，可誘導(dǎo)白念珠菌大量的基因表達(dá)改變。由此，法尼醇濃度為100 μmol/L對48 h的生物膜抑菌作用強于24 h是否與白念珠菌基因表達(dá)的改變有關(guān)，有待進一步研究探討。

綜上，法尼醇對于白念珠菌和糞腸球菌混合生物膜有一定的抑制作用，在創(chuàng)口感染及牙髓感染方面具有一定的研究前景。