金 杯，戴盼盼，孫 旺，顧衛(wèi)燕，林海升，施更生

舌癌是常見的口腔惡性腫瘤，在所有口腔癌患者中的構(gòu)成比為 32.5%～50.6%，并且手術(shù)治療難度大，對(duì)放化療特異性不佳，綜合療效不理想[1]。因此，尋找新的治療方法具有重要意義。雙硫侖(disulfiram，DSF)多年來(lái)被用于治療慢性酒精中毒，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其與臨床相關(guān)濃度的銅結(jié)合對(duì)多種惡性腫瘤顯示出抗癌作用，但是與舌癌相關(guān)的研究甚少，具體機(jī)制尚不明確。視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)調(diào)控線粒體的網(wǎng)絡(luò)融合，與線粒體功能密切相關(guān)，并在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用[2]。此外，研究發(fā)現(xiàn)OPA1與腫瘤的惡性變有關(guān)[3]。因此，本研究探討DSF-Cu對(duì)舌癌細(xì)胞Cal-27凋亡的影響以及OPA1在其中的作用，為DSF-Cu在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Cal-27(上海中喬新舟生物科技有限公司，批號(hào)ZQ0606)；MEM細(xì)胞完全培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技有限公司，批號(hào)ZQ-301)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)25200-056)；DSF(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)86720)；氯化銅(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)C3279)；(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)M2128)；二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)D5879)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)APOBRDU)；β-actin一抗(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)A1978)；ATP檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，S0026)；OPA1(BD Biosciences，批號(hào)612606)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio-TEK，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Becton，美國(guó))；電泳儀(BIO-RAD，美國(guó))；曝光儀(BIO-RAD，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑配制 DSF經(jīng)DMSO溶解并稀釋成2 mmol/L，分裝后-20 ℃保存；氯化銅用無(wú)菌PBS溶解配制成50 mmol/L后經(jīng)孔徑0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后4 ℃保存，臨用前用培養(yǎng)基將上述溶液稀釋成所需工作液濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將含100 U/mL青霉素G和100 μg/mL鏈霉素的MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞處理：對(duì)照組:MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；DSF-Cu低濃度組：50 nmol/L的DSF-Cu培養(yǎng)24 h；DSF-Cu中濃度組：100 nmol/L的DSF-Cu培養(yǎng)24 h；DSF-Cu高濃度組：400 nmol/L的DSF-Cu培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細(xì)胞增殖活性率檢測(cè) 采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后按不同分組處理后棄上清，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4 h。小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上避光低速震蕩10 min使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖活性率=(各實(shí)驗(yàn)組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 ATP含量檢測(cè) 根據(jù)ATP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用熒光素酶發(fā)光法以酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞中ATP的含量。

1.2.6 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)。將蛋白提取定量后加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min使蛋白充分變性。配制5%濃縮膠以及12%分離膠，每孔上樣20 μg蛋白，SDS-PAGE電泳分離后濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，將膜分別轉(zhuǎn)入含一抗的稀釋液中(OPA1 1∶2 000，β-actin 1∶3 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，掃描圖像并用image J軟件分析灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析以及 LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SF-Cu對(duì)Cal-27細(xì)胞增殖活性的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，50、100、200、400、600、800、1 000 nmol/L的DSF-Cu處理Cal-27細(xì)胞24 h后增殖活性均下降(P<0.05)，并且濃度越高，抑制作用越大，呈濃度依賴性。

*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，P<0.05

根據(jù)MTT結(jié)果，100 nmol/L濃度的DSF-Cu處理后達(dá)到半數(shù)抑制率，而200 nmol/L的濃度與之比較結(jié)果相近，此外，考慮600、800、1 000 nmol/L的DSF-Cu處理后細(xì)胞多數(shù)死亡，分析意義不大，因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究采用50 nmol/L低濃度、100 nmol/L中濃度以及400 nmol/L高濃度的DSF-Cu進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 DSF-Cu對(duì)Cal-27細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2倒置顯微鏡下( ×100)所示，與對(duì)照組相比，不同濃度DSF-Cu處理后細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞皺縮，貼壁不牢，并且濃度越高，抑制作用越明顯。細(xì)胞狀態(tài)與MTT結(jié)果相符。

2.3 DSF-Cu對(duì)Cal-27細(xì)胞凋亡的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)比較DSF-Cu對(duì)Cal-27細(xì)胞凋亡的作用，如圖3所示，50 nmol/L的DSF-Cu處理后與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而100、400 nmol/L的DSF-Cu處理后細(xì)胞早凋及晚凋率均顯著增加，與濃度變化呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明DSF-Cu能夠誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞凋亡。

2.4 DSF-Cu對(duì)Cal-27細(xì)胞ATP含量的影響

與對(duì)照組相比，50 nmol/L的DSF-Cu處理后細(xì)胞ATP含量稍下降(P<0.05)，而100、400 nmol/L的DSF-Cu顯著降低了細(xì)胞的ATP含量，其中400 nmol/L的濃度抑制作用最強(qiáng)，說(shuō)明DSF-Cu對(duì)ATP生成的抑制作用與濃度相關(guān)(圖4)。

圖2 不同濃度DSF-Cu對(duì)Cal-27細(xì)胞形態(tài)的影響( ×100)Fig.2 The effect of DSF-Cu on the morphology of Cal-27 cells( ×100)

A： 0 nmol/L的DSF-Cu; B： 50 nmol/L的DSF-Cu; C： 100 nmol/L的DSF-Cu; D： 400 nmol/L的DSF-Cu

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.5 DSF-Cu對(duì)OPA1蛋白表達(dá)的影響

DSF-Cu對(duì)舌癌細(xì)胞OPA1蛋白表達(dá)水平影響結(jié)果如圖5所示，低濃度50 nmol/L的DSF-Cu對(duì)OPA1蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響，而高濃度100、400 nmol/L的DSF-Cu處理后OPA1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，但兩者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

口腔癌是世界排名第十六的常見腫瘤，據(jù)估計(jì)，僅2018年就新診斷出35.5萬(wàn)病例，超過(guò)17.7萬(wàn)人死亡[4]。舌癌發(fā)病率居口腔癌首位，近年來(lái)在年輕人中發(fā)病率逐漸增加，尤其是在年輕女性中[5]。由于舌癌發(fā)病位置特殊，術(shù)后對(duì)頜面形態(tài)、功能及生活質(zhì)量均有影響，且手術(shù)難度高， 放化療療效不佳，五年生存率僅為50%～60%[1]，因此尋找療效高、副作用小的替代藥品尤為迫切?？紤]到諸如成本低、風(fēng)險(xiǎn)低和耗時(shí)少等優(yōu)點(diǎn)，將已獲批準(zhǔn)的藥物重新用作新的抗癌藥物是一種有前景的策略。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

DSF用于抗酗酒治療已經(jīng)有60多年的歷史。在過(guò)去的十年中，越來(lái)越多的證據(jù)表明DSF在治療人類癌癥方面具有巨大的潛力。DSF的抗癌活性已在體外和體內(nèi)模型中得到驗(yàn)證[6-7]。目前已證實(shí)DSF可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感，并增強(qiáng)抗癌藥的細(xì)胞毒性，可以作為輔助治療。DSF能通過(guò)靶向作用于醛脫氫酶(一種癌癥干細(xì)胞的標(biāo)志物)抑制癌癥干細(xì)胞，此外，DSF還能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[8-9]。研究表明，DSF是強(qiáng)金屬螯合劑，與Cu離子結(jié)合形成二乙基二硫代氨基甲酸銅[Cu(DDC)2]絡(luò)合物，具有優(yōu)異的抗癌功效[10]，但其在舌癌的研究甚少，并且相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，DSF-Cu有抑制舌癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的作用，并且呈濃度依賴性，符合既往研究結(jié)果。

線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力工廠，其損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量生成障礙，進(jìn)而細(xì)胞功能失調(diào)，最終發(fā)生病理性凋亡[11]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體靶向藥物通過(guò)線粒體功能障礙觸發(fā)癌細(xì)胞的凋亡較其他藥物更有效[12]，改變線粒體代謝可能是治療癌癥的潛在方向。已有研究證實(shí)，DSF-Cu能夠?qū)е戮€粒體活性氧增加，膜電位降低，引起線粒體功能紊亂，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞[13]、腦癌細(xì)胞[14]凋亡。本研究檢測(cè)DSF-Cu處理后的細(xì)胞ATP含量發(fā)現(xiàn)，DSF-Cu顯著降低癌細(xì)胞ATP含量，并且與處理濃度呈正相關(guān)，說(shuō)明DSF-Cu誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞凋亡可能與線粒體功能障礙有關(guān)。

線粒體穩(wěn)態(tài)的維持、有效的呼吸作用和線粒體DNA的遺傳取決于線粒體膜的正確結(jié)構(gòu)以及內(nèi)膜的動(dòng)態(tài)重塑。OPA1位于線粒體內(nèi)膜中，是調(diào)節(jié)線粒體融合的主要蛋白，參與線粒體的分裂、融合，維持線粒體的動(dòng)態(tài)平衡及功能[2]。線粒體分裂、融合的不平衡會(huì)導(dǎo)致線粒體動(dòng)力學(xué)改變，進(jìn)而出現(xiàn)線粒體功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。最新研究表明，OPA1與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[16-18]。應(yīng)用抗腫瘤藥物可以有效抑制OPA1表達(dá)，破壞線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，已被證實(shí)能導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞[19]、骨肉瘤細(xì)胞[20]凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)舌癌細(xì)胞中OPA1蛋白的變化，結(jié)果顯示中、高濃度的DSF-Cu能夠下調(diào)OPA1蛋白表達(dá)水平，這提示OPA1參與了DSF-Cu誘導(dǎo)的舌癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，DSF-Cu可以抑制舌癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制OPA1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，ATP合成減少來(lái)作用。本研究結(jié)果有望為DSF-Cu在抗癌治療方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。