李凌云 許曉敏 林 桓 劉廣洋 黃曉冬 高 慧 徐東輝 裴志國

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081； 2.島津企業(yè)管理 （中國）有限公司，北京 100020； 3.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085）

百菌清（chlorothalonil，CTN）是一種高效、廣譜的有機(jī)氯殺菌劑，對多種作物的真菌病害有良好的防治效果，因此在我國的蔬菜、水果、水稻等作物生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛[1]。由于百菌清在植物上的黏著性較強(qiáng)，不易被雨水沖刷，難以降解且藥效期較長等特點(diǎn)[2]，極易在蔬菜和水果中殘留，從而對農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全造成影響。大量的研究表明，百菌清對魚類和水生無脊椎動(dòng)物具有明顯的毒性，其中許多魚類的 96 h 半致死量 （LC50）為 10～195 μg/L[3]。除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)長期低劑量的百菌清暴露甚至可以抑制青春期小鼠卵巢的發(fā)育[4]。因此對蔬菜和水果中殘留的百菌清進(jìn)行快速準(zhǔn)確的測定，對于保障人們的餐桌安全至關(guān)重要。目前報(bào)道的檢測百菌清的方法主要有液相色譜法[5～6]，氣相色譜法[7～9]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10～11]。但這些檢測方法的樣品前處理過程繁瑣，不但需要SPE柱凈化，且耗時(shí)較長。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因具有抗干擾能力強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為農(nóng)藥殘留檢測的首選方法[12～15]。但百菌清的分子結(jié)構(gòu)（見圖1）中包含一個(gè)苯環(huán)和與苯環(huán)連接的4 個(gè)氯原子和2 個(gè)氰基，這樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了它在常見的電噴霧離子源 （ESI）中很難電離，因此，目前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測百菌清的研究在國內(nèi)還未見報(bào)道。本研究采用APCI 對百菌清進(jìn)行分析，建立了負(fù)離子MRM 模式的檢測方法，并將該方法應(yīng)用于蔬菜中百菌清殘留的測定。

一、實(shí)驗(yàn)部分

（一）儀器、試劑與材料LC-30A 超高效液相色譜儀和LC-MS/MS-8050 三重四極桿質(zhì)譜儀均購自日本Shimadzu 公司。

乙腈、甲醇 （HPLC 級，美國 JT Baker 公司）；乙酸銨 （HPLC 級，美國 Fluka 公司）； 水 （超純水，Milli-Q 超純水儀制備）； 百菌清 1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所； 其他試劑均為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

番茄、西葫蘆、芹菜、大白菜、花椰菜、結(jié)球甘藍(lán)分別代表茄果類、瓜類、葉菜類、白菜類和甘藍(lán)類等不同類型蔬菜。

（二）樣品處理稱取10.0 g 均質(zhì)后蔬菜試樣于 50.0 mL 離心管中，加入 20.0 mL 乙腈，振蕩提取 30 min 后 （300 r/min），加入 5.0 g 氯化鈉，手動(dòng)劇烈振搖 1 min，以 5 000 r/min 離心 3 min 后，取上層乙腈相，過 0.22 μm 濾膜，濾液供分析。

（三）儀器條件色譜柱： Phenomenex Kinetex C18 （50 mm ×3 mm，2.6 μm）； 流動(dòng)相： A 相為甲醇； B 相為乙酸銨（1.0 mmol/L）水溶液； 梯度洗脫條件： 0min，20%A； 0 ～5 min，20%～95%A；5 ～7 min，95%A； 7 ～7.1 min，95% ～20%A；7.1～12 min，20%A； 流速為 0.3 mL/min； 柱溫為40℃； 進(jìn)樣量為 1 μL。

APCI 離子源； 負(fù)離子掃描； MRM 監(jiān)測模式；電暈針電壓3 500 V； 霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量5 L/min，以上2 種氣體均為氮?dú)猓?接口溫度350℃； 脫溶劑管溫度 200℃； 加熱模塊溫度200℃； 碰撞氣壓力 2.7×105Pa，該氣體為氬氣。

二、結(jié)果與討論

（一）質(zhì)譜條件的優(yōu)化在APCI 源負(fù)離子模式下，對百菌清的一級質(zhì)譜進(jìn)行掃描 （見圖2），結(jié)果只檢測到一個(gè)離子m/z245。根據(jù)同位素比例3∶3∶1，推測該離子m/z245 為 4-羥基百菌清[C8N2OCl3]-。它可能是百菌清在離子源中發(fā)生水解反應(yīng)，4 號位的氯原子被羥基取代所致 （見圖1）。為了驗(yàn)證該結(jié)論的正確性，實(shí)驗(yàn)比較了該離子m/z245 與4-羥基百菌清母離子[M-H]-的二級譜圖（見圖3），結(jié)果表明，在相同的碰撞能量下，兩者均得到 4 個(gè)碎片離子峰m/z147、175、182 和 210，且碎片離子峰的豐度比基本一致。因此百菌清一級譜中的離子峰m/z245 即是4-羥基百菌清的質(zhì)譜峰。本實(shí)驗(yàn)以m/z245 作為百菌清的母離子，對其二級質(zhì)譜進(jìn)行分析，并選取豐度較高，干擾較小的兩對子離子m/z175、182 為定性離子，對四極桿預(yù)桿偏置電壓 （Q1 Pre Bias 和 Q3 Pre Bias）、碰撞能量（CE）等進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。百菌清的質(zhì)譜參數(shù)同樣也可以檢測4-羥基百菌清，但兩個(gè)化合物的保留時(shí)間是不同的 （見圖4）。

圖1 百菌清及其母離子的分子結(jié)構(gòu)式

圖2 百菌清的一級全掃描質(zhì)譜圖

圖 3 百菌清 （A）和 4-羥基百菌清 （B）的二級譜圖

表1 百菌清的監(jiān)測離子對及質(zhì)譜參數(shù)

（二）流動(dòng)相的優(yōu)化考察了甲醇/ 水、乙腈/水、甲醇/ 乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)對百菌清色譜行為的影響。結(jié)果顯示，利用甲醇/ 水做流動(dòng)相時(shí)，百菌清的響應(yīng)值好于乙腈/ 水做流動(dòng)相，因此本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇做有機(jī)相。另外，當(dāng)在甲醇/ 水溶液中加入1.0 mmol/L 濃度的乙酸銨時(shí)，百菌清的響應(yīng)有所提高，進(jìn)一步增加乙酸銨的濃度（2.5、5.0、10.0 mmol/L）對百菌清的響應(yīng)影響不大。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選取甲醇/1.0 mmol/L 乙酸銨溶液做為最終的流動(dòng)相。優(yōu)化條件下百菌清的色譜圖見圖4。

圖 4 4-羥基百菌清（1）和百菌清（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/L）的MRM 色譜圖

（三）基質(zhì)效應(yīng)考察在質(zhì)譜分析中，基質(zhì)中共提取的干擾物質(zhì)會影響目標(biāo)化合物的離子化，從而增強(qiáng)或抑制化合物在儀器上的響應(yīng)，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。由于基質(zhì)效應(yīng)會影響分析方法的準(zhǔn)確度，因此必須對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。本文采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。分別用溶劑和空白基質(zhì)溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

公式 （1）[17]中，k1為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，k2為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。ME為正數(shù)表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，為負(fù)數(shù)表示基質(zhì)抑制效應(yīng)。|ME| 在0～20%時(shí)，為弱基質(zhì)效應(yīng)，在20%～50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)，＞50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果如圖5所示，百菌清在各蔬菜中均表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，即基質(zhì)的存在，有助于百菌清在離子源發(fā)生脫氯水解反應(yīng)，從而使百菌清的信號增強(qiáng)。在5 種蔬菜中，番茄的基質(zhì)效應(yīng)（22.1%）最小，屬于中等基質(zhì)效應(yīng)。大白菜和西葫蘆中百菌清雖也表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)，但它們的基質(zhì)效應(yīng)較番茄高很多，分別為49.2%和47.4%。在芹菜和花椰菜中百菌清表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，分別為59.4%和59.5%。由于百菌清在各種蔬菜中的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)明顯，為了更好地消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液對百菌清進(jìn)行定量，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

圖5 百菌清在5 種蔬菜中的基質(zhì)效應(yīng)

（四）線性范圍、線性關(guān)系和定量限用番茄、芹菜、花椰菜、西葫蘆和大白菜的空白基質(zhì)溶液，分別配制質(zhì)量濃度為 0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25 和 0.5 mg/L 的百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上文檢測方法進(jìn)行分析，以色譜峰面積 （y）對其質(zhì)量濃度 （x，mg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 （見表 2）。結(jié)果顯示，在 1～500 μg/L 范圍內(nèi)，百菌清線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) （r）為 0.998 7～0.999 8。

表2 百菌清在不同基質(zhì)中的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

方法定量限 （LOQ）通過加標(biāo)回收進(jìn)行確定。符合一定正確度和精密度要求的最低加標(biāo)濃度為定量限。百菌清在番茄、芹菜、大白菜和西葫蘆4 種蔬菜中的定量限均為0.01 mg/kg。在該濃度水平下，百菌清的平均回收率為67.0%～92.6%，RSD為4.6%～13.4%，回收率和精密度數(shù)據(jù)同時(shí)滿足農(nóng)業(yè)部2386 號公告 《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》 的要求。

（五）回收率與精密度在空白番茄、芹菜、花椰菜、西葫蘆、大白菜和結(jié)球甘藍(lán)樣品中，分別添加0.01、0.1 和0.5 mg/kg 3 個(gè)濃度水平的百菌清進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測試6 次。百菌清在5 種蔬菜基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果見表3，可以看出，蔬菜基質(zhì)種類明顯影響百菌清的回收率。在番茄、芹菜、西葫蘆和大白菜4 種蔬菜基質(zhì)中，百菌清的平均回收率為67.0%～104%，RSD 為1.4%～13.4%。方法的正確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。但在甘藍(lán)類蔬菜中，百菌清的回收率明顯偏低。如在花椰菜中，3個(gè)濃度水平下百菌清的平均回收率分別為40.9%、44.0%和41.4%，而在結(jié)球甘藍(lán)中百菌清的回收率則為0。因此本研究推測可能是甘藍(lán)類蔬菜中的某些物質(zhì)與百菌清發(fā)生了降解反應(yīng)，從而導(dǎo)致百菌清的回收率偏低。在近來的研究中，王禹等[18]發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)葉片水提取液可以明顯加快百菌清的光降解速率，他們推測可能是水提液中酚類和黃酮類物質(zhì)的存在導(dǎo)致了百菌清的降解。而LV 等[19]則發(fā)現(xiàn)原花青素可以作為光敏化劑，直接促進(jìn)水中百菌清的降解。但對于本研究而言，前處理過程是在室內(nèi)完成，并沒有紫外照射，因此甘藍(lán)類蔬菜中具體什么物質(zhì)導(dǎo)致了百菌清降解，還有待進(jìn)一步研究。

表3 百菌清在5 種蔬菜基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率和精密度（RSDs）（n=6）

（六）實(shí)際樣品的檢測應(yīng)用本文所建立的方法對例行監(jiān)測抽檢的40 份蔬菜樣品中的百菌清進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，40 份樣品均未檢出百菌清。

三、結(jié)論

本研究建立了液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中百菌清殘留的快速檢測方法。樣品經(jīng)乙腈提取，過濾后直接進(jìn)行儀器檢測，省略了繁瑣的凈化步驟。該方法簡便、快速、可用于番茄、西葫蘆、芹菜和大白菜等蔬菜中百菌清的快速篩查與檢測，但不適用于花椰菜和結(jié)球甘藍(lán)等蔬菜。