黃百祺，黃創(chuàng)成，吳巨賢*，鄒琴，劉佳凡

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣東 廣州 510430；2.四會(huì)市龜靈翁水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，廣東 肇慶 526200）

龜鱉養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)近年來(lái)發(fā)展迅速的新興特種養(yǎng)殖業(yè)，其產(chǎn)值在特種養(yǎng)殖業(yè)中高居第二，主要分為食用型和觀賞型兩類(lèi)。其中食用龜養(yǎng)殖存量較大的品種主要有中華草龜（Chinemys reevesii）、黃喉擬水龜（Mauremys mutica）、中華花龜（Ocadia sinensis）和鱷龜（Chelydra serpentina）。目前，對(duì)于這些食用龜?shù)睦梅绞街饕獮辇敋?、龜板入藥，龜肉烹調(diào)食用。隨著食用龜養(yǎng)殖規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大，龜肉的銷(xiāo)售逐漸呈現(xiàn)出供大于求的市場(chǎng)局面，產(chǎn)業(yè)界對(duì)龜肉深加工技術(shù)的研究和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)有迫切需求。

酶解技術(shù)是提升肉類(lèi)產(chǎn)品風(fēng)味和改善肉類(lèi)蛋白質(zhì)特性的一種有效途徑。肉類(lèi)經(jīng)酶解后生成大量游離氨基酸和小分子肽，這些氨基酸和小肽不僅具備獨(dú)特的滋味和生理功能，可作為功能性食品添加劑，而且它們?cè)谝欢l件下還能與還原糖、脂類(lèi)等物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生肉味和烹調(diào)效果的香氣，從而制備調(diào)味品[1]。因此，利用酶解工藝進(jìn)行肉類(lèi)的高值化加工具有良好的應(yīng)用前景，受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。步營(yíng)等[2]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)蛤酶解液中總游離氨基酸和呈味氨基酸對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)度明顯高于藍(lán)蛤蒸煮液。張永生等[3]研究表明部分雞肉酶解液的Maillard反應(yīng)物風(fēng)味醇厚感較強(qiáng)。薛宇航等[4]利用酶解技術(shù)制備竹節(jié)蝦風(fēng)味前體物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)酶解液海鮮味道濃郁，非常適合用作調(diào)味品基料。由于不同蛋白酶在水解方式和酶切位點(diǎn)上存在差異，當(dāng)利用酶解技術(shù)制備肉類(lèi)水解蛋白時(shí)，蛋白酶的種類(lèi)對(duì)酶解產(chǎn)物的氨基酸組成和風(fēng)味有重要影響。堿性蛋白酶是一種絲氨酸型內(nèi)切蛋白酶，具有廣泛的底物特異性和較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力，已成功用于鰹魚(yú)[5]、鱘魚(yú)[6]、花蟹[7]、鲬?hù)~(yú)[8]等水產(chǎn)品肉類(lèi)的水解。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于龜肉精深加工的研究?jī)H在即食龜肉[9]、龜苓膏[10]和龜肉活性肽分離[11]等方面開(kāi)展了初步的探索，對(duì)于利用酶解技術(shù)制備呈味基料的報(bào)道較少。本試驗(yàn)以中華草龜、黃喉擬水龜、中華花龜和鱷龜為原料，采用堿性蛋白酶對(duì)龜肉進(jìn)行酶解，對(duì)酶解液中的氨基酸組成、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和呈味特性進(jìn)行分析對(duì)比，探討不同龜肉酶解液的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和風(fēng)味特征，以期為龜肉的高值化衍生產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃喉擬水龜、中華草龜、中華花龜、鱷龜：廣東省四會(huì)市龜靈翁水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)；堿性蛋白酶（200 000 U/g）：重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5 mmol/L）：日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA2202S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FE20型pH計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；JYS-A960型絞肉機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；BWS-12型精密恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；X3R型高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀：日立高新技術(shù)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原材料預(yù)處理

活龜宰殺后充分放血，取可食用部位肌肉，用絞肉機(jī)絞碎、混勻，置于-18℃凍藏，備用。

1.3.2 龜肉酶解液制備

酶解工藝參照文獻(xiàn)[12]的方法并略作調(diào)整，工藝流程：龜肉（50 g）→肉水比 1∶5（g/mL）→均質(zhì)→調(diào) pH值（8.0）→蛋白酶酶解（酶添加量 1%，60℃，3 h）→滅酶（95 ℃，20 min）→離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min）→上清液（酶解液）→-18℃凍藏待測(cè)。中華草龜、黃喉擬水龜、中華花龜和鱷龜肉酶解液分別記為CEH、MEH、OEH和SEH。

1.3.3 氨基酸測(cè)定

總氨基酸和游離氨基酸的測(cè)定參考GB5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定。游離氨基酸味道強(qiáng)度值（taste activity value，TAV）是指某游離氨基酸的含量與該游離氨基酸呈味閾值的比值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定均平行重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法檢驗(yàn)，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種龜肉酶解液的總氨基酸組成比較及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

作為呈味基料，肉類(lèi)酶解產(chǎn)物不僅有良好的風(fēng)味感覺(jué)，還能提供一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要取決于其總氨基酸（total amino acid，TAA）含量高低和必需氨基酸（essential amino acid，EAA）組成，TAA含量越高、EAA組成比例與人體氨基酸需要比例越接近，則其品質(zhì)越佳。4種酶解液中總氨基酸類(lèi)別及含量見(jiàn)表1。

由表 1可知，CEH、MEH、OEH和 SEH的總氨基酸中均檢測(cè)到16種常見(jiàn)氨基酸（由于采用酸水解法測(cè)定，故未檢測(cè)色氨酸含量），表明這4種龜肉酶解液中的氨基酸種類(lèi)較豐富。CEH的TAA含量（1 844.31 mg/100 g）顯著低于其他龜肉酶解液中的對(duì)應(yīng)值，OEH（1 932.48 mg/100 g）和 MEH（1 916.12 mg/100 g）之間、MEH 和 SEH（1 898.18 mg/100 g）之間的TAA含量無(wú)顯著差異。4種酶解液中含量和占TAA百分比最高的3種氨基酸均相同，依次為Glu、Asp和Lys，且均以MEH中的含量最高；4種酶解液中含量和百分比最低的氨基酸均為Met，這與Glu、Asp是中華草龜、中華花龜和黃喉擬水龜肉中含量最高的氨基酸、Met是第一限制氨基酸[13-14]的規(guī)律相似，表明酶解液中總氨基酸的組成與原料的氨基酸組成有一定的聯(lián)系。CEH、MEH、OEH和SEH中含量大于1.0 mg/g的氨基酸分別有 7、9、8 種和 7 種，Glu、Asp、Lys、Leu、Arg和Ala是其中共有的氨基酸種類(lèi)。

4種龜肉酶解液中均含有7種EAA，ΣEAA大小依次為OEH、MEH、CEH和SEH，且不同酶解液之間的差異顯著。4種酶解液中總氨基酸的ΣEAA/TAA在36.83%～40.70%之間、ΣEAA/ΣNEAA 在 58.31%～68.63%之間；其中CEH、OEH的ΣEAA/TAA約為40%，ΣEAA/ΣNEAA均大于60%，符合聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（ΣEAA/TAA為40%，ΣEAA/ΣNEAA為60%），表明其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。F值是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)類(lèi)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的指標(biāo)之一，其值越大蛋白質(zhì)的生理功能越好。MEH（2.50）和OEH（2.51）的F值差異不顯著，但均顯著高于CEH（2.38）和SEH（2.45）的F值。因此，綜合對(duì)比分析TAA、ΣEAA、ΣEAA/TAA和F值等指標(biāo)的排序，4種龜肉酶解液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大小為：OEH＞MEH＞CEH＞SEH。

2.2 4種龜肉酶解液的游離氨基酸組成比較

4種酶解液游離氨基酸類(lèi)別及含量見(jiàn)表2。

如表2所示，4種龜肉酶解液的游離氨基酸中均檢測(cè)到16種氨基酸，CEH、MEH、OEH、SEH的總游離氨基酸（total free amino acid，TFAA）含量分別為 2.191、2.551、3.394、2.610 mg/g，且不同酶解液之間的差異顯著，OEH顯著高于其他龜肉酶解液。4種酶解液的TFAA含量大小順序與其TAA含量排序不完全一致，這可能是利用相同的蛋白酶制備酶解產(chǎn)物時(shí)，底物特性對(duì)水解效率有重要影響，由于不同龜肉蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)各異，從而導(dǎo)致4種龜肉酶解液總游離氨基酸含量的差異。4種龜肉酶解液中的TFAA僅占其TAA的11.88%～17.56%，推測(cè)酶解液中大部分氨基酸以可溶性蛋白質(zhì)或短肽的形式存在。

從單一氨基酸上看，4種龜肉酶解液游離氨基酸中含量和占TFAA百分比最高的均為Phe，對(duì)于CEH、MEH 和 SEH，其次為 Leu、Tyr，對(duì)于 OEH，其次為 Val、Glu；含量最低的氨基酸為 Ser（CEH、MEH 和 SEH）和Pro（OEH）。4種酶解液游離氨基酸中含量最高的3種氨基酸占TFAA的總百分比在44.39%～54.23%之間，與白鰱魚(yú)[15]、鯽魚(yú)[16]等水產(chǎn)品酶解液中含量最高的幾種氨基酸在TFAA中的占比規(guī)律相似。4種酶解液游離氨基酸中的疏水性氨基酸占比均大于64%，是酶解液中主要的氨基酸種類(lèi)，與耿翠竹等[17]研究結(jié)果一致。16種氨基酸在每種龜肉酶解液的游離氨基酸和總氨基酸中含量和所占百分比的排序不完全一致，這可能是由于試驗(yàn)所用的蛋白酶對(duì)不同氨基酸的底物特異性和酶切效率不同[18]，導(dǎo)致酶解液中游離氨基酸的組成與總氨基酸相比發(fā)生變化。

由表2可知，OEH中的ΣEAA/TFAA值顯著高于其他龜肉酶解液的對(duì)應(yīng)值，MEH和SEH中的ΣEAA/TFAA值無(wú)顯著差異，但均顯著高于CHE中的對(duì)應(yīng)值。4種酶解液游離氨基酸中的ΣEAA/TFAA和ΣEAA/ΣNEAA 分別介于 56.50%～63.64%、129.86%～175.02%之間，均高于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)，且大于其龜肉蛋白質(zhì)和酶解液總氨基酸中的對(duì)應(yīng)值，表明經(jīng)過(guò)酶解后EAA得到了有效釋放，更有利于人體吸收和利用。

2.3 4種龜肉酶解液的游離氨基酸呈味特性比較

游離氨基酸根據(jù)其呈味特性可劃分為鮮味、甜味和苦味3類(lèi)，其含量、比例及相互作用是影響食物風(fēng)味的關(guān)鍵因素之一。4種酶解呈味氨基酸含量及占總游離氨基酸百分比見(jiàn)表3。

表3 4種酶解呈味氨基酸含量及占總游離氨基酸百分比Table 3 Content and proportion of flavor amino acid in total free amino acid in four kinds of emydidae meat enzymatic hydrolysate

如表3所示，3類(lèi)呈味氨基酸含量大小對(duì)4種龜肉酶解液風(fēng)味貢獻(xiàn)的規(guī)律相似，均為苦味氨基酸最大，甜味氨基酸次之，鮮味氨基酸最小。3類(lèi)呈味氨基酸含量均以O(shè)EH最高、CEH最低，且不同酶解液之間的差異顯著，說(shuō)明龜肉來(lái)源對(duì)其酶解產(chǎn)物風(fēng)味影響較大。從占TFAA的百分比上看，OEH中的鮮味、甜味氨基酸及兩者之和均顯著高于其他酶解液，而苦味氨基酸顯著低于其他酶解液。

由于不同氨基酸的味道閾值存在差異，游離氨基酸的絕對(duì)含量與其對(duì)食物風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度不是簡(jiǎn)單的比例關(guān)系，故通過(guò)味道強(qiáng)度值（taste activity value，TAV）變換對(duì)4種龜肉酶解液中的呈味氨基酸進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 4種龜肉酶解液呈味氨基酸的TAV值Table 4 TAV of flavor amino acid in four kinds of emydidae meat enzymatic hydrolysate

由表4可知，4種酶解液中僅有OEH中Glu的TAV大于1，這可能是由于在本試驗(yàn)中原料為中輕度水解，導(dǎo)致酶解液中游離氨基酸的含量不高所致[3]。

Glu和Asp除了能提供鮮味外，還能增加食品的甜味感覺(jué)以及滋味的厚度和持久性，由于一般食物中Glu的含量更高且閾值更低，故普遍認(rèn)為其對(duì)食物鮮味的提升作用比Asp更大[19]。每種龜肉酶解液中Glu的TAV值均在所有呈味氨基酸中排列前3位，且均大于各自酶解液中Asp的TAV值，因此Glu是龜肉酶解液中的主要鮮味來(lái)源。在4種酶解液中，Glu在OEH中具有最大的TAV值，且其含量、占TFAA百分比均顯著高于其他酶解液。

4種龜肉酶解液中TAV值最大的甜味氨基酸均為Ala，且明顯高于其他甜味氨基酸的TAV值，是龜肉酶解液甜味的主要來(lái)源。Ala對(duì)蝦、蟹等[20]水產(chǎn)品的鮮甜滋味有重要貢獻(xiàn)，是一種重要的甜味氨基酸，可與Glu等鮮味氨基酸起到協(xié)同提鮮效果。4種酶解液中Ala的TAV值最大的是OEH，含量最高的是OEH且顯著高于其他酶解液，占TFAA百分比最高的是MEH且顯著高于其他酶解液。除了Ala外，Gly也是許多水產(chǎn)品酶解液中重要的甜味氨基酸[19]，一般認(rèn)為其對(duì)風(fēng)味的作用僅次于Glu，但本試驗(yàn)中4種酶解液中Gly的TAV值遠(yuǎn)小于Ala的對(duì)應(yīng)值，這可能是由原料和蛋白酶特性上的差異所造成的。

4種龜肉酶解液中苦味氨基酸TAV值的排序規(guī)律有較大差異，CEH、MEH中TAV值最大的苦味氨基酸均為Phe，其次是Met和Val，OEH中為Val、Phe和Arg，而SEH中則為His、Phe和Val。4種酶解液中苦味氨基酸的TAV值均小于1，Lioe等[21]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)苦味氨基酸含量低于其呈味閾值時(shí)，有增強(qiáng)其他氨基酸鮮味和甜味的作用。

總體上，龜肉酶解液呈味氨基酸的組成與含量與龜肉味甘、咸平的風(fēng)味特性較吻合，推測(cè)龜肉酶解液的風(fēng)味與其原料特性存在一定的聯(lián)系。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)中華草龜、黃喉擬水龜、中華花龜和鱷龜肉堿性蛋白酶酶解液中的總氨基酸、游離氨基酸和呈味特性進(jìn)行了測(cè)定和分析。結(jié)果在4種龜肉酶解液的總氨基酸和游離氨基酸中均檢測(cè)到常見(jiàn)的16種氨基酸。4種酶解液總氨基酸中含量和百分比最高的3種氨基酸和最低的氨基酸一致，分別為Glu、Asp、Lys和Met。OEH的TAA含量、F值在4種酶解液中最高，ΣEAA/TAA和ΣEAA/NEAA值與FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)較接近，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

4種龜肉酶解液的游離氨基酸中疏水性氨基酸所占比重較大，含量和百分比最高的單個(gè)氨基酸均為Phe，總游離氨基酸含量最高為OEH。4種酶解液中游離氨基酸的ΣEAA/TFAA值和ΣEAA/NEAA值明顯大于其總氨基酸中的對(duì)應(yīng)值，且高于部分水產(chǎn)品酶解產(chǎn)物中的對(duì)應(yīng)值。呈味特性分析顯示，苦味氨基酸和甜味氨基酸對(duì)龜肉酶解液風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，4中酶解液中OEH的鮮味、甜味氨基酸含量和百分比最高而苦味氨基酸最低。4種酶解液中僅有OEH中Glu的TAV大于1。本試驗(yàn)為人工養(yǎng)殖食用龜龜肉呈味基料的開(kāi)發(fā)和高值化加工技術(shù)研究提供理論依據(jù)。