鐘平娟，葉麗芳，門戈陽，鄧澤元*，鐘瑞敏，*，藍(lán)鑫

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.韶關(guān)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；3.廣東廣三農(nóng)生物科技有限公司，廣東 韶關(guān) 512528)

大果山楂又名廣山楂、澀梨，為薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物，主要分布在我國廣西、廣東、福建等南方地區(qū)。成熟時呈黃色或黃綠色，與北方盛產(chǎn)的紅山楂外觀上有明顯區(qū)別[1-2]。大果山楂富含酚酸、多酚、黃酮和多糖等功能成分，并具有抗氧化、抑菌、降壓、降脂、保肝、抗腫瘤和加強(qiáng)心肌收縮力等多種生物活性[2-7]。大果山楂每公頃產(chǎn)量可達(dá)30噸以上，但肉質(zhì)硬實(shí)、酸而澀，不太適宜鮮吃。隨著對大果山楂的藥理和經(jīng)濟(jì)價值的深入研究，廣西、廣東等地區(qū)的栽培面積不斷擴(kuò)大，面臨大規(guī)模深加工的需求。

傳統(tǒng)的大果山楂加工方式主要是通過腌制、干燥等工藝制備果脯、果干等，其它類型加工方式的報(bào)道很少[8-10]。根據(jù)大果山楂果肉特性和化學(xué)成分特點(diǎn)，為保留生物活性成分和豐富的原果風(fēng)味，前期研究了大果山楂酒發(fā)酵的優(yōu)化工藝，結(jié)果表明，通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)果酒可有效釋放大果山楂果肉組織的生物活性成分，并形成類似于香檳的清爽酒香。鑒于還沒有文獻(xiàn)對大果山楂酒的活性成分和抗氧化活性以及香氣成分進(jìn)行報(bào)道。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)擬采用頂空固相微萃?。╤ead-space solid-phase micro extraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用對不同發(fā)酵時段的樣品香氣成分進(jìn)行提取與分析，并對不同發(fā)酵時段的樣品的總酚含量以及抗氧化性進(jìn)行研究，旨在為開發(fā)優(yōu)質(zhì)大果山楂酒高值化途徑提供更為科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂鮮果：韶關(guān)銳新達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司。葡萄酒高活性干酵母（BV818型）：湖北安琪酵母股份有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；福林酚試劑（分析純）：上海荔達(dá)生物科技有限公司；沒食子酸一水合物（分析標(biāo)準(zhǔn)品）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸（純度≥98.0%）：上海吉如生物科技有限公司；DPPH：東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱（SPX-250B-D）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；30 L全自動發(fā)酵系統(tǒng)（Bwg-6030型）：匯和堂生物工程設(shè)備（上海）有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1901）：北京普析通用儀器有限公司；數(shù)顯集熱式磁力攪拌器（DF101B）：金壇大地自動化儀器廠；氣質(zhì)聯(lián)用儀（QP-2010型）：日本島津公司；膠體磨（E2-100 L-2）：上海德東電機(jī)廠；數(shù)顯糖度計(jì)（PAL-1）：ATAGO（愛拓）中國分公司；平板密閉離心機(jī)（PSB800）：張家港市遠(yuǎn)華機(jī)械制造廠；立式硅藻土過濾機(jī)（LY-400-20）：上海濾盈設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫發(fā)酵制備大果山楂酒

采用前期優(yōu)化的工藝進(jìn)行果酒制備。選取成熟度高、無病害果，于90℃熱水中熱燙5 min，冷卻后添加果重等量的水再經(jīng)膠體磨打成細(xì)漿。于48℃恒溫果膠酶酶解2 h，調(diào)整糖度至22°Bx，升溫85℃滅菌15 min，冷卻后加入偏亞硫酸鉀。接種0.45%安琪低溫釀酒酵母于24℃進(jìn)行恒溫酒精發(fā)酵，將酵母接入大果山楂發(fā)酵醪的時間記作0 h，第0 h即為大果山楂原漿，此時不含酒精，設(shè)置大果山楂酒樣品采集時間分別為6、24 h，以后每隔12 h取一次樣。直至殘?zhí)呛康陀? g/L時結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液離心去渣，硅藻土過濾機(jī)精濾得到澄清的淡黃色大果山楂原酒。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 理化分析

1）酒精度：酒精計(jì)法。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

2）總酸含量：指示劑法。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

3）殘?zhí)呛浚褐苯拥味ǚ╗11]。

4）總酚含量：Folin-Ciocalteu比色法，以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，765 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)[12]，得到回歸方程為 y=0.0106x+0.025 7，R2=0.996 3。

5）DPPH自由基清除能力測定：以VC標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，對 DPPH·清除率為縱坐標(biāo)[13]，得到回歸方程為 y=0.380 1x+2.348 9，R2=0.996 3，本試驗(yàn)測定DPPH·清除能力用VC當(dāng)量（VCEAC）來評價不同發(fā)酵階段大果山楂果酒的抗氧化能力。

6）ABTS+·清除能力測定：以VC標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，對ABTS+·清除率為縱坐標(biāo)[14]，得到回歸方程為y=0.623 6x+0.659 8，R2=0.999 3，本試驗(yàn)測定ABTS+·清除能力用VC當(dāng)量（VCEAC）來評價不同發(fā)酵階段大果山楂果酒的抗氧化能力。

1.3.2.2 果酒芳香成分GC/MS測定

1）香氣成分的提取

取5 mL樣品溶液置于20 mL頂空瓶中，加入1 g氯化鈉，再加入叔丁醇20 μL做為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量檢測，加蓋密封搖勻，于50℃水浴中平衡15 min，然后將老化好的 50/30 μm，DVB/CAR/PDMS針頭插入樣品瓶中，推出纖維頭，保持在45℃恒溫頂空吸附40 min，然后取出插入到GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)行揮發(fā)性成分分離鑒定。

2）色譜條件

HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：柱箱溫度初始40℃保持2 min，以5℃/min升至80℃，再以3℃/min升到120℃，最后以10℃/min升至250℃，保持5 min；載氣為高純氦氣（99.999%），分流比為10∶1。進(jìn)樣口溫度：250℃，載氣：He，壓力48.95kPa；分流比為 10∶1，流速 1 mL/min。質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度250℃，EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描方式SCAN，質(zhì)量掃描范圍30 amu～550 amu，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫 NTST05。

各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)聯(lián)用儀的計(jì)算機(jī)譜庫NIST 05.L檢索并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照，并結(jié)合已有的報(bào)道進(jìn)行定性分析。

1.3.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 22進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組及以上數(shù)據(jù)的組間顯著性差異采用單因素方差分析、最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)采用（±SD）表示，p＜0.05 為差異顯著。用Pearson雙側(cè)檢驗(yàn)法對總酚含量、DPPH自由基清除能力以及ABTS+·清除能力進(jìn)行相關(guān)性分析，p＜0.05表示有顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大果山楂酒發(fā)酵過程中酒精度的變化

大果山楂鮮果經(jīng)熱燙鈍酶護(hù)色、破果和酶解液化后接種經(jīng)活化的釀酒酵母進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵，發(fā)酵過程中酒精度變化情況如圖1所示。

圖1 大果山楂酒釀造過程中酒精度變化Fig.1 Dynamic changes in the alcohol content of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine during brewing

發(fā)酵第1天分別在6 h和24 h取樣，平均酒精度分別達(dá)到（3.1±0.10）%vol和（7.9±0.06）%vol。此后每隔12 h取樣跟蹤酒精度變化，酒精度持續(xù)升高，72 h時達(dá)到峰值（12.7±0.10）%vol，96 h后測得殘?zhí)堑陀? g/L，酒精度為（12.1±0.06）%vol。造成以上酒精度變化的原因可能是發(fā)酵初期，酵母代謝旺盛，所需營養(yǎng)物質(zhì)充足，可用于自身生長繁殖與酒精發(fā)酵，使得酒精度迅速上升，隨著酒精度的升高，糖類物質(zhì)被消耗，酒精度變化趨于平穩(wěn)。與許多水果的果酒釀造周期7 d～15 d相比，大果山楂酒能在24℃發(fā)酵溫度下第1天酒精度就達(dá)到（7.9±0.06）%vol，并在72 h時酒精度達(dá)到最大，96 h結(jié)束整個干型果酒的發(fā)酵過程，其發(fā)酵速度是非常快的。一方面說明這種商用釀酒酵母活力較強(qiáng)，接種量適宜，同時也說明大果山楂果漿含有較全面的營養(yǎng)成分能夠很好地滿足釀酒酵母持續(xù)酒精發(fā)酵的代謝需求。對于果酒液態(tài)深層發(fā)酵，縮短發(fā)酵周期意味生產(chǎn)效率較高，也有利于減少因發(fā)酵蒸騰作用對原果香味造成的損失，這在果酒的實(shí)際生產(chǎn)過程中非常重要[15]。

2.2 大果山楂酒發(fā)酵過程中總酚的變化

果酒的酚類物質(zhì)具有抗氧化和抗誘導(dǎo)有機(jī)體突變等作用，同時可賦予果酒醇厚、豐滿、結(jié)構(gòu)感強(qiáng)，后味悠長的特點(diǎn)[16]，可提高酒的耐儲存能力。大果山楂果發(fā)酵過程總酚的變化如圖2所示。

圖2 大果山楂酒發(fā)酵過程總酚的變化Fig.2 Dynamic changes of total phenols during the brewing period of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine

由圖2可知，發(fā)酵前大果山楂原漿的總酚含量為（1.53±0.02）GAE mg/mL，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總酚含量有所降低，但在整個發(fā)酵過程中總酚含量基本保持較小的變化幅度，發(fā)酵結(jié)束時總酚含量為（1.24±0.03）GAEmg/mL。大果山楂酒在整個發(fā)酵過程中總酚含量相對平穩(wěn)，保留率均超過80%，而對比其他果酒發(fā)酵過程中總酚含量的變化，哈之才[17]發(fā)現(xiàn)寒富蘋果酒發(fā)酵過程中總酚含量保留率僅為40%左右，且呈波動減少趨勢。胡冀太[18]發(fā)現(xiàn)山楂酒發(fā)酵過程中總酚含量呈上升趨勢，而李楠等[19]發(fā)現(xiàn)山楂酒發(fā)酵過程中總酚含量幾乎保持平穩(wěn)。可見果酒發(fā)酵過程中對總酚含量變化的研究結(jié)果并不一致，這可能與水果自身特性、發(fā)酵工藝條件（如浸漬工藝、發(fā)酵溫度、時間）等有關(guān)。本試驗(yàn)中大果山楂汁帶渣發(fā)酵，在發(fā)酵6 h開始檢測到總酚含量有所降低，其原因可能是大果山楂經(jīng)磨漿、酶解后已充分釋放果肉組織中的酚類物質(zhì)，總酚含量達(dá)到峰值，而在發(fā)酵過程中因氧化和微生物代謝作用有所降低[20-21]。

2.3 大果山楂酒發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化

在大果山楂酒發(fā)酵過程中，對不同時段的樣品檢測了DPPH自由基清除能力和ABTS+·清除能力，以此來判斷大果山楂酒抗氧化活性與總酚含量變化的相關(guān)性。大果山楂酒釀造期間自由基清除能力的變化如圖3所示。

圖3 大果山楂酒釀造期間自由基清除能力的變化Fig.3 Changes of free radical scavenging ability during the brewing period of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine

如圖3所示，發(fā)酵前的大果山楂原漿自由基清除能力最高，發(fā)酵開始后，果酒的自由基清除能力有所下降。在整個發(fā)酵過程中，DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力基本保持較小的變化幅度，這個變化與果酒中總酚含量變化趨勢基本相似，說明大果山楂酒的抗氧化能力主要與總酚含量有關(guān)。通過相關(guān)性分析可知，大果山楂酒抗氧化能力與其總酚含量呈正相關(guān)。這一現(xiàn)象與報(bào)道的白葡萄酒、紅葡萄酒、果酒和糯米酒發(fā)酵過程中酒樣的抗氧化活性變化相一致[22-23]。此外，DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力二者較為一致，通過Person相關(guān)性分析，它們的相關(guān)系數(shù)為 0.774（p＜0.05）。

2.4 大果山楂酒發(fā)酵過程中芳香成分的變化

在大果山楂酒發(fā)酵過程中，對不同時段樣品的芳香物質(zhì)進(jìn)行檢測，對樣品中相對含量超過0.5%的成分進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，大果山楂酒發(fā)酵過程中各類香氣物質(zhì)含量的變化如圖4所示，大果山楂酒發(fā)酵過程中各種香氣物質(zhì)相對含量的變化如表1所示。大果山楂發(fā)酵前的大果山楂原漿中含有豐富的香氣成分，發(fā)酵成果酒之后仍然能保持相應(yīng)的香氣成分。

圖4 大果山楂酒發(fā)酵過程中各類香氣物質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of the contents of various aroma substances during the fermentation of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine

表1 大果山楂酒發(fā)酵過程中各種香氣物質(zhì)相對含量的變化Table 1 Changes of relative contents of various aroma substances during the fermentation of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine mg/100 mL

從動態(tài)發(fā)酵過程中檢測出51種成分，由圖4可知，主要是酯類、醇類和醛酮類成分，其特征成分包括苯甲醛、苯乙醇、異辛醇、己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯、3-羥基己酸乙酯、苯乙醛等，這些成分也是常見的水果芳香成分，共同構(gòu)成大果山楂原味果香[24-28]。使得發(fā)酵之后的大果山楂酒具有香檳的香氣。

在大果山楂酒發(fā)酵過程及結(jié)束后形成的果酒中，芳香風(fēng)味成分種類及含量與發(fā)酵前的大果山楂原漿相比均發(fā)生了明顯變化。由圖4可知，發(fā)酵6 h～24 h醇類、酯類含量呈上升趨勢，這可能是因?yàn)榇寂c?；o酶A是酯合成的底物，隨著醇類含量的上升，酯類含量也相應(yīng)上升[29]，適宜的醇類物質(zhì)含量可將酯類物質(zhì)香氣凸顯出來，使得香氣更加協(xié)調(diào)。發(fā)酵結(jié)束后樣品中酯類和醇類成分的含量均有顯著提高，這些成分中辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯和棕櫚酸乙酯等屬于發(fā)酵產(chǎn)生的新的代謝酯香成分。

由圖4和表1可知，在發(fā)酵前，己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯和3-羥基己酸乙酯含量占酯類物質(zhì)的60.5%。而在整個發(fā)酵過程中，辛酸乙酯占酯類物質(zhì)含量基本保持在14.5%～36.9%，而辛酸乙酯具有類似白蘭地的香氣并帶有甜味。發(fā)酵結(jié)束后，辛酸乙酯和癸酸乙酯占酯類物質(zhì)含量最高，達(dá)到55.74%。苯乙醇作為原果芳香成分，同時也是酵母代謝產(chǎn)生的特征性成分，其含量增加量最高，發(fā)酵結(jié)束時占醇類物質(zhì)的89.4%，苯乙醇不僅具有殺菌作用，還能賦予果酒玫瑰和茉莉花香，給人產(chǎn)生柔和愉悅的感覺。大果山楂原漿香味成分在發(fā)酵過程中存在變化，總體上香味因發(fā)酵的蒸騰作用有所減弱。其中異辛醇、己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯、3-羥基己酸乙酯、乙酸苯乙酯、鄰苯二甲酸二乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、苯甲酸乙酯等原果香味成分雖有變化，但保留量也相對較多，保留率為50%～90%，這些成分屬于識別大果山楂酒的重要原果香味。以上酯類和醇類特征成分共同構(gòu)成了大果山楂酒的淡雅清香。但苯甲醛、苯乙醛、順-9-十六碳烯酸甲酯等含量較高的原果香味成分在發(fā)酵終點(diǎn)基本檢測不到。

3 結(jié)論

通過分析不同發(fā)酵時段樣品的總酚含量、自由基清除能力以及利用HS-SPME結(jié)合GC-MS對大果山楂酒發(fā)酵過程中的香氣成分進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，經(jīng)成分保護(hù)性預(yù)處理和果酒發(fā)酵，大果山楂成分可實(shí)現(xiàn)有效釋放，獲得較快的干型果酒發(fā)酵速度，既保證了生產(chǎn)效率，同時對提高果酒品質(zhì)也有重要作用。在發(fā)酵過程中，總酚含量略有損失，但保存率均在80%以上，而且其自由基清除能力與總酚含量高度關(guān)聯(lián)?？焖侔l(fā)酵對形成大果山楂酒類似香檳特征的淡雅清香也十分重要，除形成新的代謝性酯類和醇類酒香成分以外，原果芳香成分保留量較高。基于以上試驗(yàn)結(jié)果，利用大果山楂可以開發(fā)高品質(zhì)果酒，但在后期陳釀、碳酸化調(diào)配等工藝技術(shù)等方面還值得進(jìn)一步研究和探索。