王露楠 ，楊少玲，戚 勃，楊賢慶，李春生，馬海霞，胡 曉

（1. 上海海洋大學食品學院，上海 201306； 2. 中國水產科學研究院南海水產研究所/國家水產品加工技術研發(fā)中心/農業(yè)農村部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300）

瓊膠是一種天然的高分子多糖，存在于石花菜科、江蘺科等海洋藻類的細胞壁中[1]，其主鏈由1,3-β-D-半乳糖和 1,4-3,6 內醚-α-L-半乳糖交替連接而成，同時含有少量的硫酸基、甲氧基和丙酮基等基團[2]。瓊膠因其良好的凝膠性能、凝膠溫度滯后性和生物活性被廣泛應用于食品、生物和醫(yī)藥等領域[3]。然而，天然瓊膠存在分子量大，溶解性能、溶液澄清度和透明度不高等缺陷，應用范圍受到很大限制。冷飲食品行業(yè)需要低溫速溶的瓊膠[4]；微生物檢驗行業(yè)需要高透明、高澄清性能的瓊膠[5]；攪拌混合型物料加工中需要耐機械剪切性能的瓊膠[6]，但天然瓊膠并不具備應用市場所需求的這些功能特性。因此，對瓊膠進行適當?shù)母男匝芯?，賦予其新的理化性能，是解決瓊膠應用缺陷的主要方法[7]。

研究表明，通過化學改性取代瓊膠分子上的活性羥基，瓊膠的理化性質、分子結構和穩(wěn)定性會發(fā)生改善，從而具備更好的理化性質和功能特性，以滿足不同行業(yè)對瓊膠的特殊需求[8-9]。近年來，許多學者對天然淀粉高分子的物理或化學改性做了大量研究，開發(fā)出不同理化特性的改性淀粉，并得到了廣泛應用[10]。目前，瓊膠改性研究主要集中在對瓊膠進行降解制備瓊膠寡糖方面，但實際得到有效應用和產品開發(fā)方面還基本處于空白，其他有關瓊膠改性的研究也相對較少[11]。

針對市場對瓊膠改性技術和不同應用特性產品的需求，本文借鑒成熟的淀粉改性技術 (羧甲基化、氧化和羥丙基化) 對天然瓊膠進行改性研究，比較分析了3種改性方法對瓊膠理化性質、凝膠特性、結構特征和熱穩(wěn)定性的影響，以期為建立瓊膠改性新技術提供理論支撐，并為開發(fā)不同應用特性的瓊膠新產品提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊膠粉由汕頭市澄海區(qū)瓊膠廠提供；氯乙酸(北京百靈威科技有限公司)；30%過氧化氫、環(huán)氧丙烷、氫氧化鈉、無水乙醇等 (廣州化學試劑廠)，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV2550紫外可見光光度計 (日本島津公司)；IRAffinity-1紅外光譜儀 (日本島津公司)；CR-400色差儀 (日本Konica Minolta公司)；HH-4快速恒溫數(shù)顯水浴鍋 (常州澳華儀器有限公司)；CT 3質構儀 (美國Brookfield公司)；BS224S分析天平(美國Sartorius公司)；DSC100差示掃描量熱儀(南京大展機電研究所)；其他均為實驗室常用儀器設備。

1.3 方法

1.3.1 改性瓊膠制備方法 1) 羧甲基瓊膠。參考別蒙等[12]的方法，略作修改。稱取5 g瓊膠粉分散至50 mL、80% (體積分數(shù)，下同) 的乙醇溶液中，40 ℃下攪拌溶脹0.5 h，加入0.5 g氫氧化鈉 (NaOH)，繼續(xù)攪拌堿化反應2 h后，再向錐形瓶中加入1.16 g氯乙酸 (ClCH2COOH)，同時補充0.5 g NaOH。最終 n(瓊膠)∶n(ClCH2COOH)∶n(NaOH) 的摩爾比為1∶1.5∶0.75。封口后，在55 ℃下磁力攪拌5 h后結束反應。自然冷卻至常溫，用1 mol·L?1冰醋酸 (CH3COOH) 溶液將體系調pH 至7.0，再用真空抽濾收集濾餅，濾餅用60%乙醇洗滌、抽濾，反復操作至濾液中無氯離子 (Cl?) 檢出，所得濾餅在60 ℃烘干，粉碎、過80目篩，得到羧甲基瓊膠(Carboxymethyl agar, CMA)。

2) 氧化瓊膠。參考Xiao等[13]的方法，略作修改。稱取25 g瓊膠粉分散至250 mL 45%乙醇溶液中，用1 mol·L?1NaOH溶液調pH至9.0，然后緩慢滴加11 mL 30%過氧化氫 (H2O2) 溶液，30 ℃保溫反應3 h，然后用1 mol·L?1冰醋酸溶液調pH至7.0，真空抽濾收集濾餅，濾餅用60%乙醇溶液洗滌、抽濾，反復操作3次，最后將濾餅在60 ℃烘干，粉碎、過80目篩，得到氧化瓊膠 (Oxidized agar, OA)。

3) 羥丙基瓊膠。參考Zhang等[14]的方法，略作修改。稱取30 g瓊膠粉于錐形瓶中，加入210 mL去離子水和1 g無水硫酸鈉 (Na2SO4)，攪拌使其分散均勻，加入0.3 g NaOH，在恒溫水浴鍋中升溫至45 ℃，逐滴滴加30 mL的環(huán)氧丙烷 (C3H6O)，密封反應12 h。反應結束后，用1 mol·L?1的冰醋酸溶液將反應液pH調至7.0，真空抽濾收集濾餅，濾餅再用60%的乙醇溶液洗滌、抽濾，反復操作3次，最后在60 ℃烘干，粉碎、過80目篩，得到羥丙基瓊膠 (Hydroxypropyl agar, HPA)。

1.3.2 瓊膠物理性質測定[15]1) 溶解溫度測定。配制質量分數(shù)為1.5%的瓊膠溶液混合均勻后，置于50 ℃恒溫水浴鍋中，逐漸升溫，升溫速率為1 ℃·min?1，記錄瓊膠完全溶解時的溫度，即為瓊膠的溶解溫度。

2) 凝膠溫度測定。將步驟1) 溶解后的瓊膠溶液倒入25 mL試管至2/3，用帶溫度計的試管塞封住試管口 (溫度計水銀球浸入液面以下)，將試管放置在試管架自然冷卻凝膠，當傾斜試管時，凝膠剛好不流動時的溫度，即為瓊膠的凝膠溫度。

3) 凝膠再溶溫度測定。將步驟2) 凝膠的試管于4 ℃冰箱靜置4 h，然后在凝膠表面放置1粒直徑為5 mm的玻璃珠，同樣置于水浴鍋內以1 ℃·min?1的升溫速率加熱，記錄玻璃珠下降到試管底部時的溫度，即為瓊膠凝膠的再溶溫度。

4) 瓊膠凝膠強度測定。參照《GB 1975—2010食品安全國家標準 食品添加劑瓊脂 (瓊膠)》附錄A.5中規(guī)定的方法制備瓊膠凝膠，凝膠在20 ℃條件下恒溫24 h，采用質構儀測定凝膠強度，測定探頭為1 cm2圓柱形探頭，測試速度為1.0 mm·s?1。

1.3.3 瓊膠色澤測定 瓊膠的顏色采用CR-400色彩色差儀在D65光源下測定，結果用CIE [ 亮度 (L*)，紅綠值 (a*)，黃藍值 (b*)] 表示，并通過亨特白度指數(shù)(WH)進行比較，WH值越大，表示白度越高[16]。

1.3.4 凝膠透明度測定 參考杜建華等[17]的方法，略做修改。配制質量分數(shù)為1.5%的瓊膠溶解液，趁熱轉移至1 cm具塞比色皿中，室溫放置過夜后，在波長700 nm處測定樣品透過率 (Transmittance, T)。

1.3.5 凝膠質構特性測定 用CT3質構儀測定。將質量分數(shù)為1.5%的瓊膠凝膠切割成直徑為1.5 cm、高1.5 cm的圓柱形小塊，置于樣品臺上，選擇TPA模式，選擇T11圓柱探頭，測試速度1.0 mm·s?1，觸發(fā)點載荷5 g，壓縮比30%，記錄瓊膠凝膠的硬度、內聚性、彈性和咀嚼性[18]，測定3次取平均值。

1.3.6 凝膠析水率測定 參考李曉藝等[19]的方法，略作修改。將1.5%瓊膠凝膠切割成規(guī)則的2 cm×2 cm×2 cm立方體，置于帶蓋離心管中，稱質量，分別在?18 ℃、?3 ℃、4 ℃和25 ℃下放置 24 h，解凍后以 6 000 r·min?1的轉速離心10 min，用濾紙吸去凝膠表面水分，再次稱質量。析水率(%)按下式計算：

式中m1為凝膠初始質量 (g)；m2為離心后凝膠質量 (g)。

1.3.7 傅里葉紅外光譜 (Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR) 測定 采用FT-IR方法對瓊膠的化學結構進行定性分析。為了避免水分干擾，溴化鉀 (KBr) 在105 ℃干燥10 h，在紅外燈下與瓊膠混合研磨成粉，壓片后在4 000～400 cm?1的波長范圍內測量。并用OMNIC 8.2軟件進行數(shù)據分析。

1.3.8 瓊膠熱穩(wěn)定性測定 參考《GB/T 22232—2008 化學物質的熱穩(wěn)定性測定 差示掃描量熱法》規(guī)定的方法。加熱范圍為25～300 ℃，升溫速率為15 ℃·min?1，氣氛為氮氣，得到樣品的差示掃描量熱法 (DSC) 曲線。

1.3.9 數(shù)據處理 采用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析，每組試驗做3次平行，結果用“平均值±標準差 (X ±SD)”表示，用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同改性方法對瓊膠物理性質的影響

羧甲基化和羥丙基化改性可顯著降低瓊膠的溶解溫度、凝膠溫度、凝膠再溶溫度和瓊膠強度(P＜0.05)，氧化改性法可顯著降低瓊膠的溶解溫度、凝膠再溶溫度 (P＜0.05)，對瓊膠的凝膠溫度無顯著影響 (P＞0.05)，對瓊膠強度有顯著增強作用(P＜0.05)。其中羧甲基化對4項指標降低最為明顯，羥丙基化次之，氧化法最弱 (表1)。改性瓊膠物理指標下降的原因是由于NaOH或氧化劑的存在使瓊膠發(fā)生不同程度的降解、分子量降低；另外改性后的瓊膠分子上引入羧甲基或羥丙基基團，這些基團的親水性使得瓊膠更易溶脹，尤其是受熱時瓊膠分子鏈得到不同程度的伸展，而基團間的相互排斥作用阻礙了瓊膠雙螺旋體聚集、抑制了凝膠形成，使得瓊膠的凝膠溫度和凝膠強度降低。此外，瓊膠分子結構的改變也抑制了瓊膠分子三維網狀結構的形成或使網狀結構更為疏散，水分子更容易進入網狀結構，凝膠在形態(tài)轉化時需要的能量也更低，因此瓊膠的溶解溫度和凝膠再溶溫度降低[20]。氧化瓊膠凝膠強度高達1 463 g·cm?2，較原瓊膠提高了48.7%。氧化瓊膠凝膠強度提高的主要原因是H2O2處理后硫酸鹽含量的減少和乙醇洗滌過程中去除了部分雜質[21]。

表1 改性對瓊膠物理性質的影響Table 1 Effects of modifications on physical properties of agar

2.2 不同改性方法對瓊膠色澤和凝膠透明度的影響

瓊膠作為常用的食品添加劑，在其發(fā)揮作用的同時應盡量不改變食品原有的色澤[22]，因此瓊膠的色澤和凝膠透明度是瓊膠品質的重要指標。由表2可知，經過改性處理，羧甲基瓊膠的L*顯著降低(P＜0.05)，氧化瓊膠和羥丙基瓊膠L*顯著提高(P＜0.05)；羧甲基瓊膠的a*和b*顯著升高 (P＜0.05)，說明其顏色呈現(xiàn)偏黃的趨勢，而氧化瓊膠和羥丙基瓊膠的a*和b*顯著降低 (P＜0.05)，表明其顏色偏綠；氧化瓊膠和羥丙基化瓊膠的WH顯著增大(P＜0.05)，羧甲基化瓊膠白度WH顯著減小 (P＜0.05)。瓊膠白度提高可能是因為改性過程中乙醇洗滌在去除試劑殘留的同時，也使葉綠素、類胡蘿卜素和藻膽素等有色物質溶出[23]，羧甲基瓊膠白度降低 (感官顏色偏黃) 可能由反應體系強堿環(huán)境所致[24]；透過率 (T) 的大小反映凝膠是否透明，T越大，凝膠越透明。羧甲基化、氧化和羥丙基化瓊膠的T較原瓊膠顯著提高 (P＜0.05)，分別為82.21%、55.70%和68.60%，是原瓊膠 (23.93%) 的3.4、2.3和2.9倍。瓊膠凝膠透明度直接反映瓊膠分子與水分子的親和力，瓊膠改性引入的負電荷基團相互排斥，使得分子鏈間距增大，分子易舒展，水分子快速填充，光線發(fā)生透射程度高，反射程度低，因此改性瓊膠表現(xiàn)出良好的透明度[25]。

表2 改性對瓊膠色澤和凝膠透明度的影響Table 2 Effects of modifications on color and gel transparency of agar

2.3 不同改性方法對瓊膠凝膠質構特性的影響

采用質地多面剖析法 (Textural profile analysis,TPA) 對瓊膠進行質構分析，測定瓊膠凝膠硬度、內聚性、彈性及咀嚼性表征其質構性能。由表3可見，與原瓊膠相比，羧甲基和羥丙基化瓊膠凝膠彈性和內聚性顯著提高 (P＜0.05)，尤其是羧甲基化瓊膠最明顯，但凝膠的硬度和咀嚼性均顯著降低(P＜0.05)，表明羧甲基和羥丙基化后，瓊膠變得軟彈，抵抗外力作用的能力減弱，恢復原有形狀的能力增強，凝膠柔韌性增強。這可能是由于帶電基團的相互斥力導致形成的凝膠結構較松散[26]。氧化瓊膠的質構特性與原瓊膠相比無顯著變化 (P＞0.05)。通過改性可以得到不同質構特性的瓊膠，可為食品行業(yè)提供更多的選擇。

表3 改性對瓊膠凝膠質構的影響Table 3 Effects of modifications on gel texture properties of agar

2.4 不同改性方法對瓊膠凝膠析水率的影響

瓊膠持水能力的高低取決于其凝膠的析水率，析水率越低，瓊膠的持水能力越強。凝膠在不同溫度下的持水性反映了瓊膠凝膠對溫度變化的穩(wěn)定性。4種瓊膠在?18 ℃析水率最高，?3 ℃析水率最低 (圖1)，說明適當?shù)蜏赜欣诃偰z凝膠保持較好的持水能力。在?18 ℃冷凍環(huán)境下，氧化瓊膠的析水率高于原瓊膠，而羧甲基化和羥丙基化后瓊膠的析水率大幅降低，說明羧甲基瓊膠和羥丙基瓊膠具有較好的凍融穩(wěn)定性。這種現(xiàn)象可能是由于氧化瓊膠中硫酸基含量相對較低，在凝膠形成過程中，形成的雙螺旋結構也較長，表現(xiàn)為凝膠強度提高，但這種結構在低溫下也容易被破壞，使結合的水分子析出[27]，因此析水率提高。相反，對于羧甲基化和羥丙基化瓊膠，因適量降解和帶電基團的引入，形成的凝膠呈較短的雙螺旋結構，移動性好，結合水分子的能力增強，導致析水率減弱；另外經羧甲基化和羥丙基化后，瓊膠分子上的羥基被取代而減少，導致瓊膠分子間氫鍵的形成變得困難，并且引入基團間的排斥作用使瓊膠分子的空間位阻變大，使瓊膠能夠保持較好的持水能力[28]，導致析水率降低，表現(xiàn)出較好的凍融穩(wěn)定性。原瓊膠的析水率較高，可能由于其分子上的羥基在凝膠狀態(tài)下易形成氫鍵，這種氫鍵對瓊膠凝膠結合的水分子具有排擠作用。4種瓊膠中羧甲基化瓊膠在不同溫度下均表現(xiàn)出最低的析水率，表明羧甲基化能夠更有效地提高瓊膠凝膠的持水能力，這可能與羧甲基的親水性有關。

圖1 不同溫度下的析水率差異Figure 1 Difference of syneresis rate at different temperatures

2.5 傅里葉變換紅外光譜

原瓊膠的紅外光譜顯示在3 700～3 000 cm?1處出現(xiàn)較寬的伸縮振動峰，是瓊膠上?OH分子內和分子間氫鍵拉伸的結果（圖2）；在約2 900 cm?1出現(xiàn)吸收峰屬于C?H的對稱伸縮振動特征峰，是典型的多糖特征吸收峰[29]；1 640 cm?1處出現(xiàn)C＝O鍵的伸縮振動吸收峰；1 250 cm?1處存在一較弱峰，由O＝S＝O不對稱伸縮振動引起，表明瓊膠中存在著少量的硫酸基；1 070 cm?1處為內醚環(huán)上C?O?C醚鍵的伸縮振動；在921 cm?1和865 cm?1處的吸收峰是由于吡喃環(huán)上的?CH2伸縮振動引起的[30]。瓊膠經過改性后在3 700～3 000 cm?1處的吸收峰變弱，說明瓊膠分子上的羥基含量減少，這是?OH被取代的結果。改性后的瓊膠在1 150 cm?1和1 070 cm?1與原瓊膠有不同的吸收峰，這些峰和瓊膠骨架有關，表明改性處理的瓊膠空間結構發(fā)生了變化。在羧甲基瓊膠的FT-IR圖譜中，1 600 cm?1出現(xiàn)羧酸鹽?COO?的不對稱伸縮振動吸收峰，1 420 cm?1附近出現(xiàn)次甲基?CH伸縮振動弱吸收峰，表明羧甲基被成功地引入瓊膠分子中[31]。氧化瓊膠與原瓊膠的紅外光譜沒有明顯變化，氧化瓊膠在1 439 cm?1處的吸收峰略強于原瓊膠，說明瓊膠經H2O2處理后，發(fā)生氧化的程度較低。瓊膠經羥丙基化后在1 439 cm?1出現(xiàn)C?O單鍵的伸縮振動吸收峰，可能由羥丙基與瓊膠上的活性羥基締合引起的，證明羥丙基被一定程度地加到了瓊膠分子骨架上。

圖2 瓊膠改性前后的FT-IR光譜對比Figure 2 Comparison of FT-IR spectra before and after modification of agar

2.6 不同改性方法對瓊膠熱穩(wěn)定性的影響

改性處理不同程度地影響著瓊膠的熱穩(wěn)定性，原瓊膠在約265 ℃出現(xiàn)瓊膠晶區(qū)熔融吸熱峰，起始溫度245 ℃，結束溫度290 ℃。羧甲基改性后，該吸熱峰出現(xiàn)在258 ℃處，熔融起始溫度230 ℃，結束溫度270 ℃，整體向左偏移 (圖3)，說明羧甲基化降低了瓊膠的熱穩(wěn)定性。這可能是由于羧甲基的引入，致使瓊膠分子間和分子內氫鍵被破壞，作用力減弱，破壞了其原有的致密結構。此外，羧甲基化過程中的強堿環(huán)境使得瓊膠分子鏈長度變短，熱穩(wěn)定性降低[32]。相反，經過氧化和羥丙基化改性后，在約280 ℃出現(xiàn)瓊膠的熔融吸熱峰，在260 ℃開始熔融，結束溫度290 ℃，氧化和羥丙基化處理提高了瓊膠熱穩(wěn)定性。原因可能是氧化過程中H2O2的脫硫酸鹽作用和羥丙基化過程引入的羥丙基團產生的空間位阻作用保護了苷鍵在高溫下斷裂。決定瓊膠熱穩(wěn)定性強弱的本質因素是瓊膠本身的結構[33-34]。當引入不同的基團，瓊膠的熱穩(wěn)定性也隨之改變。

圖3 瓊膠改性前后的差示掃描量熱法對比Figure 3 Comparison of DSC before and after modification of agar

3 結論

本文比較了3種化學改性方法對天然瓊膠性質的影響。結果表明，3種改性方法對瓊膠的理化性質、色澤、凝膠透明度、凝膠質構特性和熱穩(wěn)定性均有不同程度的改變。通過比較可以得出，羧甲基化后，瓊膠白度和熱穩(wěn)定性降低，可溶于約65 ℃的熱水，冷卻形成的凝膠質地較為軟彈，透明度大幅提高，同時表現(xiàn)出優(yōu)秀的持水能力。羧甲基改性對瓊膠的理化性質影響最大，宜作為制備低溶點速溶軟凝膠的方法。和天然瓊膠相比，氧化瓊膠在?18 ℃時的凍融穩(wěn)定性稍差，但其他理化性質均優(yōu)于天然瓊膠，尤其是凝膠強度增加了48.7%。因此在適當?shù)臏囟群蚿H下，過氧化氫處理是一種改良瓊膠整體品質的有效手段。羥丙基化后，瓊膠的白度、熱穩(wěn)定性和溶解性能得到改善，制得的凝膠更透明，持水能力更強，但凝膠強度會隨著改性的程度增大而降低。瓊膠IR分析顯示，改性瓊膠均保持瓊膠的基本結構，氧化瓊膠只發(fā)生輕微氧化作用，羧甲基化和羥丙基化瓊膠發(fā)生了羥基取代反應?？傮w而言，本文的3種改性方法可制備出不同應用特性的瓊膠，有望在食品、生物和醫(yī)藥等領域發(fā)揮特定的作用，也為進一步深入研究瓊膠的改性機制及應用提供了理論基礎。