王秋權(quán) 黃莎莎 袁永一 康東洋 吳婕 張昕 戴樸

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，國(guó)家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100853）

人類基因組上存在各種形式的遺傳變異和多態(tài)性，隨著各種基因工程技術(shù)的深入開展，單個(gè)核苷酸變異引起的多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）的突變機(jī)制及其與遺傳性疾病的關(guān)聯(lián)性更清晰明了，但其僅能闡明人類疾病復(fù)雜遺傳因素的一小部分。越來(lái)越多證據(jù)表明，拷貝數(shù)變異（Copy Number Variations,CNVs）可能解釋其余復(fù)雜遺傳因素。作為遺傳多樣性的一種普遍形式，CNVs被認(rèn)為是與參考基因組相比，基因組DNA中大小為幾十個(gè)堿基（＞50bp）到幾Mb的DNA拷貝數(shù)變異現(xiàn)象，包括基因組重復(fù)、缺失、倒置和易位等，其中重復(fù)和缺失是最常見的[1]。

早在1959年，Lejeune及團(tuán)隊(duì)就發(fā)現(xiàn)人類基因組中存在長(zhǎng)度大于5Mbp的基因變異[2]。2004年Iafrate小組和Sebat團(tuán)隊(duì)分別報(bào)道人類基因組中CNVs以多態(tài)性廣泛存在，通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其涉及的基因組區(qū)域包含許多參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝等功能的基因，且與多種出生缺陷疾病相關(guān)[3,4]。2006年,Redon團(tuán)隊(duì)鑒定出涵蓋360Mbs大小，覆蓋人類基因組全長(zhǎng)約12%，共計(jì)1447個(gè)拷貝數(shù)變異區(qū)，并發(fā)布第一代人類基因組CNVs圖譜[5]。千人基因組計(jì)劃也已發(fā)現(xiàn)了100萬(wàn)個(gè)短插入或缺失和2萬(wàn)個(gè)CNVs位點(diǎn)[6]，這極大程度地?cái)U(kuò)展了人類對(duì)遺傳學(xué)領(lǐng)域的認(rèn)知?；蚪M變異數(shù)據(jù)庫(kù)（Database of Genomic Variants,DGV）整理并收錄了現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)報(bào)道的CNVs數(shù)據(jù)，目前發(fā)現(xiàn)CNVs約983845個(gè)，所覆蓋的基因組片段占人類基因組的29%以上，遠(yuǎn)超SNPs。CNVs突變率大約是SNPs突變率的100～10000倍[7]，對(duì)基因組遺傳變異的多樣性具有重要意義（詳見表1）。相對(duì)SNPs的概念,將人群中等位基因頻率＞1%的CNVs定義為基因組拷貝數(shù)多態(tài)（Copy Number Polymorphisms,CNPs），超過90%的CNVs屬于這一類型，而頻率＜1%的CNVs稱為罕見CNVs[8]。

表1 CNVs與SNPs的比較Table 1 CNVs versus SNPs

在臨床上常見兩類CNVs：復(fù)發(fā)性CNVs和非復(fù)發(fā)性CNVs[9]。復(fù)發(fā)性CNVs斷裂點(diǎn)常位于包含大量片段重復(fù)的固定區(qū)域，所以這類CNVs在不同個(gè)體中的情況基本一致，大量的不同臨床表型被證實(shí)與復(fù)發(fā)性CNVs相關(guān)。與之不同，非復(fù)發(fā)性CNVs的斷裂點(diǎn)處于特定序列區(qū)域，難獲取準(zhǔn)確序列數(shù)據(jù)，且微觀同源性較低，在端點(diǎn)連接處具有短插入或鈍端。部分致病性及非致病性CNVs屬于此類。大多數(shù)非復(fù)發(fā)性CNVs是簡(jiǎn)單的刪除或串聯(lián)重復(fù)，但也有一些非常復(fù)雜，表現(xiàn)為數(shù)十個(gè)事件聚集在單個(gè)基因組區(qū)域中[10]。

1 CNVs的突變機(jī)制

目前提出的解釋大多數(shù)CNVs形成的機(jī)制主要有四種，包括非等位基因同源重組（Nonallelic Homologous Recombination,NAHR），非同源末端連接(Non-homologous End Joining,NHEJ)，復(fù)制叉停滯和模板轉(zhuǎn)換機(jī)制(Fork Stalling and Template Switching,FoSTeS)及反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子驅(qū)動(dòng)機(jī)制，對(duì)幾種主要機(jī)制特點(diǎn)及對(duì)比詳見表2。

表2 CNVs形成主要機(jī)制的特點(diǎn)及比較Table 2 Characteristics and comparison of the main mechanisms of CNVs formation

1.1 非等位基因同源重組

NAHR是由彼此具有高度同源性的兩個(gè)非等位基因DNA序列之間的比對(duì)和交叉引起的。據(jù)估計(jì)，大約28%的CNV可能通過NAHR形成而來(lái)[11]，是串聯(lián)重復(fù)和缺失的重要來(lái)源[12]。NAHR發(fā)生位點(diǎn)的分布存在重組熱點(diǎn)現(xiàn)象，即存在有順式作用基序（motif）“CCNCCNTNNCCNC”的富集[13]。NAHR可在減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生帶有CNVs的配子，并可遺傳給后代[14]。

1.2 非同源末端連接機(jī)制

一些結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的CNVs則可能是源自NHEJ。NHEJ是修復(fù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(DNA Double Strand Break，DSB)的關(guān)鍵機(jī)制，當(dāng)雙鏈斷裂時(shí)，如果來(lái)自不同染色體的兩個(gè)片段連接在一起，就會(huì)導(dǎo)致基因缺失和重復(fù)。有研究表明，56%的CNVs由NHEJ引起的。其產(chǎn)生的CNVs斷點(diǎn)更集中于重復(fù)序列內(nèi)部或周圍,某些可以引起DSB或DNA彎曲的DNA基序（如TTTAAA）附近也比較容易出現(xiàn)CNVs。由于NHEJ發(fā)生時(shí)不需要高度同源性的DNA序列反應(yīng)底物，并可能會(huì)有部分堿基插入連接處，這些使其與其他CNVs產(chǎn)生機(jī)制有所差異[15]。

1.3 復(fù)制叉停滯和模板轉(zhuǎn)換機(jī)制

2007年Lee通過對(duì)基因組重排的觀察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA的復(fù)制叉停滯時(shí)，滯后鏈將會(huì)從模板上脫落，通過微同源序列轉(zhuǎn)到另一個(gè)空間位置上接近的復(fù)制叉重新開始合成DNA，從而導(dǎo)致拷貝數(shù)刪除或重復(fù)，而轉(zhuǎn)換和重新合成可能會(huì)連續(xù)發(fā)生多次，導(dǎo)致更復(fù)雜的重排，據(jù)此提出了FoSTeS模型。而新復(fù)制叉在起始復(fù)制叉的上下游決定CNVs的類型[16]。

1.4 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子驅(qū)動(dòng)機(jī)制

在人體中，逆轉(zhuǎn)座子可在三個(gè)方面上介導(dǎo)CNVs形成。首先，人類基因組中的某些逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子仍然活躍，具有多態(tài)性，這些可被認(rèn)為是CNVs本身[17]。其次，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座機(jī)制有時(shí)會(huì)導(dǎo)致加工過的mRNA整合回到基因組中，可能導(dǎo)致基因劑量的增加[18]。最后，逆轉(zhuǎn)座子可能改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)可塑性而促進(jìn)大片段CNVs的形成[19]。

2 CNVs與遺傳性耳聾的相關(guān)研究

聽力損失是臨床上最常見的致殘性疾病之一，全球約有4.66億人口因聾致殘，約占全球人口的5%，每1000個(gè)新生兒中就有2-3名耳聾或聽力障礙患者,其中大約50%-60%是由遺傳因素引起的[20,21]，作為基因組變異的一種重要表現(xiàn)形式，CNVs也在遺傳性耳聾的多基因遺傳研究中越來(lái)越多的被發(fā)現(xiàn)。

早在1998年，Laer等人在DNFA5基因座上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)插入/缺失突變，這是首次報(bào)道CNVs導(dǎo)致非綜合征耳聾的文章[22]。2001年，Verpy等人通過候選耳聾基因方法發(fā)現(xiàn)STRC基因存在大片段的刪除[23]。2012年，F(xiàn)rancey等人鑒定出17個(gè)STRC基因缺失，發(fā)現(xiàn)大片段CNVs是STRC基因的主要突變類型[24]。據(jù)評(píng)估，在日本散發(fā)的明確遺傳因素的中重度感音神經(jīng)性聾患兒中，約1/3與STRC基因CNVs有關(guān)[25]。越來(lái)越多的研究證實(shí)CNVs是遺傳性耳聾的常見原因之一，2014年Richard研究組發(fā)表的第一篇CNVs在遺傳性耳聾的大宗病例報(bào)道，發(fā)現(xiàn)在明確分子病因的患者中CNVs參與致病者占18.7%，涉及16個(gè)基因的143種CNVs[26]。同年，復(fù)旦大學(xué)李華偉團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)79名散發(fā)耳聾患者進(jìn)行檢測(cè)，在27個(gè)耳聾基因中發(fā)現(xiàn)了CNVs[27]。

OTOA基因被認(rèn)為是第二常見的受CNVs影響的耳聾基因，已有近30個(gè)在不同種族人群導(dǎo)致聽力損失的OTOA基因缺失CNVs被報(bào)道[28]。在綜合征型耳聾基因中也發(fā)現(xiàn)了大量CNVs，如覆蓋EYA1基因的18q13基因片段上發(fā)生的缺失CNVs正是腮耳腎綜合征的病因之一，EYA1基因部分外顯子的重復(fù)也可導(dǎo)致此綜合征的發(fā)生[29,30]。此外，至少有50個(gè)CNVs發(fā)生在USU2A基因上而導(dǎo)致Usher綜合征[31]。截至目前已有64個(gè)耳聾基因被報(bào)道發(fā)生CNVs。在雙側(cè)耳聾患者中，20%的致聾基因被鑒定為存在CNVs，15%接受基因檢測(cè)的患者攜帶有CNVs[32]。

3 遺傳性耳聾CNVs的致病機(jī)制

目前研究表明，人類基因組CNVs并不是隨機(jī)分布,近40%的CNVs更傾向分布于基因沙漠區(qū)，但仍有大量疾病易感基因或致病基因定位于CNVs區(qū)域，可解釋多達(dá)20%的個(gè)體異常表型[5,33]。CNVs可通過基因破壞、基因融合、劑量效應(yīng)、位置效應(yīng)等機(jī)制導(dǎo)致疾病[34]。

CNVs可直接對(duì)聽力功能所必需的蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生有害影響,從而導(dǎo)致耳聾。當(dāng)CNVs累及整個(gè)基因時(shí)會(huì)導(dǎo)致耳聾發(fā)生，如當(dāng)OTOA基因發(fā)生純合缺失時(shí)，其編碼序列缺失而無(wú)法編碼Otoancorin蛋白，使耳蝸蓋膜發(fā)生異常導(dǎo)致耳聾[35]；當(dāng)基因調(diào)控/啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生CNVs時(shí)也會(huì)引起耳聾，POU3F4基因僅在上游增強(qiáng)子區(qū)域發(fā)生CNVs時(shí)便可導(dǎo)致內(nèi)耳發(fā)育異常[36]。此外，CNVs可能會(huì)導(dǎo)致隱性基因暴露，如當(dāng)TMPRSS3基因雜合變異時(shí)，復(fù)雜的基因組重排導(dǎo)致基因破壞，產(chǎn)生無(wú)效等位基因而導(dǎo)致耳聾[37]。

由于CNVs片段長(zhǎng)度比較長(zhǎng)，可能涵蓋數(shù)個(gè)基因，且其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此其也可能通過影響分子表型或基因組表型異質(zhì)性，進(jìn)而導(dǎo)致耳聾發(fā)生，所以需要更好的了解CNVs對(duì)基因表達(dá)的影響，以評(píng)估其在遺傳性耳聾復(fù)雜性狀中的作用。

CNVs導(dǎo)致遺傳性耳聾所涉及的具體基因及機(jī)制仍需進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證。對(duì)遺傳性耳聾來(lái)說(shuō)，有學(xué)者提出致病性CNVs應(yīng)被定義為：1)覆蓋已知致聾基因的編碼區(qū)，臨床表型及遺傳模式與已報(bào)道的該基因表型及模式吻合；2)覆蓋已知的致病CNVs；3)新發(fā)的CNVs或在多個(gè)受累家庭成員中發(fā)現(xiàn)已知引起疾病的基因突變與表型共分離CNVs；4)位于一個(gè)基因富集的區(qū)域；5)具有大片段的變異，CNVs處于特異的、富含基因序列的區(qū)域；6)為稀有CNVs，在內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)/公共數(shù)據(jù)庫(kù)人群攜帶率＜1%[38]。

4 CNVs的檢測(cè)方法

近年來(lái)，研究人員提出了很多與標(biāo)準(zhǔn)參照基因進(jìn)行比較的CNVs檢測(cè)技術(shù),以確定變異區(qū)域的拷貝數(shù)及斷點(diǎn)位置為其重點(diǎn)研究方向,但不同的檢測(cè)方法及其應(yīng)用的計(jì)算策略在變異類型和CNVs拷貝數(shù)鑒定，及斷點(diǎn)位置準(zhǔn)確度等方面各有優(yōu)劣[39]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitive Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR）是首先用于目標(biāo)區(qū)域CNVs的檢測(cè)技術(shù),其敏感性高，操作簡(jiǎn)單，污染少，重復(fù)性好，但其不能進(jìn)行高通量CNVs檢測(cè)。多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）是對(duì)待檢DNA靶序列進(jìn)行定性和半定量分析的檢測(cè)技術(shù)，具有通量高，靈敏度高,特異性強(qiáng)，可重復(fù)性好的特點(diǎn)，但其只能檢測(cè)已知序列，且探針的特異性要求高，無(wú)法檢測(cè)出易位、倒位等情況。染色體微陣列分析技術(shù)中常用的微陣列比較基因組雜交（Array-based Comparative Genomic Hybridization，aCGH）技術(shù)使用雙雜交策略檢測(cè)待測(cè)樣本位點(diǎn)的拷貝數(shù)變化，由于其可同時(shí)分析數(shù)萬(wàn)個(gè)基因，因此被廣泛地應(yīng)用于全基因組CNVs檢測(cè)及產(chǎn)前診斷CNVs檢測(cè)中，但其不能檢測(cè)到倒位、易位及低水平的嵌合體，也無(wú)法檢測(cè)斷點(diǎn)信息，且對(duì)單拷貝數(shù)不敏感。下一代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)，其具有高通量及高分辨率的特性，可對(duì)CNVs進(jìn)行深度挖掘，精確定位和鑒定，除此之外其還可檢測(cè)到覆蓋全染色體非整倍體、大及更低比例的嵌合，基于NGS的CNV-seq也越來(lái)越多地應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中[40]。但其受限于讀長(zhǎng)短特性，并易受覆蓋率影響，很難檢出較小的CNVs，且對(duì)斷點(diǎn)的精確定位仍存在困難。

目前，檢測(cè)技術(shù)都具有一定優(yōu)勢(shì)及不足，僅使用一種方法還不能完全的檢測(cè)出一個(gè)個(gè)體基因組所包含的所有CNVs。測(cè)序技術(shù)正朝通量更高，讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，精度更高和成本更低的方向發(fā)展，如基于納米孔測(cè)序原理的第三代測(cè)序技術(shù)(Third Generation Sequencing，TGS)，其不再需要PCR擴(kuò)增過程，可對(duì)每一條DNA分子進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序，更好地解決復(fù)雜重復(fù)序列、高GC等問題。由于其長(zhǎng)讀長(zhǎng)的特性，可準(zhǔn)確檢測(cè)CNVs，確定CNVs片段參考數(shù)據(jù)，更可以精確地定位CNVs的準(zhǔn)確位置，找到確切斷點(diǎn)信息[41]。

5 小結(jié)及展望

人類基因組中存在大量的CNVs,遺傳效應(yīng)遠(yuǎn)大于SNPs，對(duì)CNVs的研究更有助于對(duì)基因組變異與疾病間關(guān)系的深入理解。對(duì)于CNVs和耳聾基因突變的綜合作用，尤其是在正常聽力個(gè)體中CNVs多態(tài)性的認(rèn)識(shí)，我們?nèi)蕴幱谠缙陔A段。隨著對(duì)CNVs研究方法及檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，可使我們更深入了解耳聾相關(guān)致病基因CNVs的致病機(jī)制，進(jìn)一步理解遺傳性耳聾的表型及遺傳變異之間的關(guān)系，為遺傳性耳聾患者群體提供更有價(jià)值的分子診斷信息，指導(dǎo)臨床發(fā)現(xiàn)新的治療方法，以及制定更好的預(yù)防策略。