趙文法 王春雷 馮家龍
山東省聊城市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東聊城 252000
甲狀腺是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺,分泌的甲狀腺激素是維持人體正常代謝和生長(zhǎng)發(fā)育所必需的激素。甲狀腺功能低下或亢進(jìn)可致體內(nèi)甲狀腺激素水平過(guò)低或過(guò)高,都會(huì)引起各種癥狀。甲狀腺片為甲狀腺激素藥,是主要由豬、牛、羊的甲狀腺經(jīng)過(guò)加工制得的生化藥品。有促進(jìn)分解代謝(升熱作用)和合成代謝的作用,對(duì)人體正常代謝及生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響,對(duì)嬰幼兒中樞神經(jīng)的發(fā)育甚為重要,臨床使用量大,多用于治療各種原因引起的甲狀腺功能減退癥[1-3]。甲狀腺激素的基本作用是誘導(dǎo)新生蛋白質(zhì)包括特殊酶系的合成,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪三大物質(zhì),以及水、鹽和維生素的代謝。由于甲狀腺激素誘導(dǎo)細(xì)胞膜Na+-K+泵的合成并增強(qiáng)其活力,使能量代謝增強(qiáng)。甲狀腺激素主要包括甲狀腺素(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)兩種。
甲狀腺片為國(guó)家基本藥物目錄收載品種,現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國(guó)藥典》[4]2015 年版二部,本課題組在檢驗(yàn)過(guò)程中,在對(duì)該品種進(jìn)行微生物限度方法適用性試驗(yàn)時(shí),發(fā)現(xiàn)個(gè)別樣品的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率不符合規(guī)定,有一定程度的抑菌性。因該品種系取豬、牛、羊等食用動(dòng)物的甲狀腺體,為單一成分動(dòng)物性組織,結(jié)合目前國(guó)內(nèi)動(dòng)物飼養(yǎng)存在抗生素濫用情況,本課題組推測(cè)其存在抗生素殘留的可能性??股卦谌梭w內(nèi)蓄積,使人產(chǎn)生對(duì)抗生素的抗性,還可造成耐藥菌感染,給臨床治療帶來(lái)困難,嚴(yán)重時(shí)可引起各種組織器官病變,甚至癌變。在參考大量文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上[5-15],本課題組對(duì)甲狀腺片中7 種喹諾酮類(lèi)藥物殘留情況進(jìn)行了研究,建立了液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)法,該方法檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高,可用于甲狀腺片中喹諾酮類(lèi)藥物殘留的檢測(cè),保障臨床用藥的安全性。
ACQUITY 超高效液相色譜儀(Waters),AB Sciex Q-TRAP 5500 三重四極桿質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI);AE240 電子天平(0.01 mg)(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q Integral 超純水儀(Millipore 公司)。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):恩諾沙星(Dr.Ehrenstorfer GmbH,批號(hào):50106,含量以99.2%計(jì))、環(huán)丙沙星(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所,批號(hào):201901,濃度100 μg/mL)、培氟沙星(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所,批號(hào):201906,濃度100 μg/mL)、氧氟沙星(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所,批號(hào):201906,濃度100 μg/mL)、洛美沙星(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):201603,含量以90.4%計(jì))、沙拉沙星(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所,批號(hào):201901,濃度100 μg/mL)、諾氟沙星(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所,批號(hào):201901,濃度100 μg/mL)。樣品甲狀腺片為2019 年度山東省藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃“甲狀腺片專(zhuān)項(xiàng)”抽檢藥品。甲醇、乙腈和甲酸為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。
色譜柱:ACQUITYUPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱溫:40℃;以乙腈為流動(dòng)相A,以1%甲酸為流動(dòng)相B,按表1 中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;質(zhì)譜檢測(cè)器。
表1 梯度洗脫表
采用ESI,蒸發(fā)溫度為550℃,氣簾氣壓力為30 psi,噴霧氣壓力為55 psi,輔助加熱氣壓力為55 psi,離子化電壓為5500 V。選擇正離子掃描方式,多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM),7 種成分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。
2.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 分別精密稱(chēng)取恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星和諾氟沙星對(duì)照品各適量,加甲醇制成各含1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星和諾氟沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液各適量用初始流動(dòng)相分別制成1、5、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,備用。
2.3.2 供試品溶液制備 取本品研細(xì),混勻,精密稱(chēng)取約2.0 g,置50 mL 具塞離心管中,加入4 mL 水,渦旋2 min,再加入10 mL 的1%乙酸乙腈,渦旋5 min,超聲處理(功率400 W,頻率40 kHz)30 min,放冷至室溫,4000 r/min(離心半徑=25 cm)離心5 min(溫度低于5℃),上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中,重復(fù)提取,合并上清液,準(zhǔn)確移取5 mL 于10 mL 離心管中,45℃下氮吹至近干,用1 mL 溶解液(乙腈∶水=2∶8)重新溶解,加乙腈飽和的正己烷3 mL,渦旋混合脫脂凈化,5000 r/min 離心3 min,靜置分層,取下層溶液用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,作為供試品溶液[8]。提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。
表2 7 種成分的質(zhì)譜參數(shù)
圖1 7 種對(duì)照品提取離子流圖
取“2.3.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo),待測(cè)物質(zhì)峰面積(A)為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程,結(jié)果表明7 種成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)表3。
表3 線性關(guān)系結(jié)果及定量限
取濃度為20 ng/mL 混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6 次,測(cè)得各被測(cè)成分峰面積的RSD 分別為恩諾沙星(1.5%)、環(huán)丙沙星(2.2%)、培氟沙星(1.8%)、氧氟沙星(1.7%)、洛美沙星(2.0%)、沙拉沙星(2.3%)、諾氟沙星(2.2%),表明儀器的精密度良好。
取濃度為20 ng/mL 混合對(duì)照品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得7 種被測(cè)成分峰面積的RSD 分別為恩諾沙星(2.3%)、環(huán)丙沙星(2.0%)、培氟沙星(2.5%)、氧氟沙星(2.2%)、洛美沙星(2.9%)、沙拉沙星(3.2%)、諾氟沙星(2.5%),表明其在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
精密稱(chēng)取已知含量的甲狀腺片(批號(hào):014180801)6 份,每份2.0 g,精密加入混合對(duì)照品溶液適量,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制成低、中、高3 個(gè)不同濃度的供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率,7 種喹諾酮類(lèi)藥物平均加樣回收率均在85.0%~100.0%范圍內(nèi)。分別為恩諾沙星(99.1%)、環(huán)丙沙星(90.8%)、培氟沙星(96.7%)、氧氟沙星(96.2%)、洛美沙星(98.8%)、沙拉沙星(89.2%)、諾氟沙星(91.5%),符合分析要求。見(jiàn)表4。
表4 加樣回收率結(jié)果(n=6)
按上述方法對(duì)收到的30 批樣品進(jìn)行檢測(cè),其中5 批樣品檢出氧氟沙星,5 批樣品均來(lái)自同一生產(chǎn)企業(yè),批號(hào)分別為180201、180803、180806、181004、190301,其他均未檢出。檢出氧氟沙星殘留的5 批次樣品與微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)時(shí),發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率不符合規(guī)定的批次一致[16]。
甲狀腺片系取豬、牛、羊等食用動(dòng)物的甲狀腺體,為單一成分動(dòng)物性組織,結(jié)合目前國(guó)內(nèi)動(dòng)物飼養(yǎng)存在抗生素濫用情況,存在抗生素殘留的可能性。抗生素在人體內(nèi)蓄積,使人產(chǎn)生對(duì)抗生素的抗性,給臨床治療帶來(lái)困難,抗生素還可以誘導(dǎo)一些微生物產(chǎn)生耐藥菌株,導(dǎo)致人類(lèi)過(guò)敏,甚至更大的危害。甲狀腺片主要用于甲狀腺功能低下和甲狀腺功能減退患者,需要長(zhǎng)期服藥,藥品中如果有抗生素殘留,可能會(huì)對(duì)服用者產(chǎn)生一定危害,甲狀腺片現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有抗生物殘留檢查項(xiàng)目,經(jīng)筆者了解,因?yàn)槿狈ο嚓P(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和參考依據(jù),生產(chǎn)廠家對(duì)原料抗生素殘留檢驗(yàn)的種類(lèi)和頻次各不相同。建議盡快出臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)增加相關(guān)的檢驗(yàn)項(xiàng)目,對(duì)甲狀腺片及其原料中抗生素的含量進(jìn)行控制,以便更好地控制甲狀腺片的質(zhì)量,以免對(duì)服用者產(chǎn)生危害。
喹諾酮類(lèi)藥物化學(xué)性質(zhì)相似,分離困難,用常規(guī)液相色譜方法實(shí)現(xiàn)分離造成每次進(jìn)樣時(shí)間很長(zhǎng)。LC-MS/MS 法表現(xiàn)出的高選擇性、高靈敏度,不要求各成分完全分離,大大縮短了分析時(shí)間。采用質(zhì)譜檢測(cè)器,用MRM 方式測(cè)定,可以有效避免干擾,專(zhuān)屬性更強(qiáng),可以準(zhǔn)確測(cè)定樣品中藥物殘留的含量。通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化了不同色譜柱和不同流動(dòng)相體系,結(jié)果顯示,采用ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱,乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫,待測(cè)組分分離效果好,檢測(cè)靈敏度較高。質(zhì)譜分析中,對(duì)各被測(cè)成分的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,喹諾酮類(lèi)藥物成分在正離子模式下有較高的響應(yīng)和較好的峰形。
參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21312-2007[15]供試品制備方法[提取:稱(chēng)取均質(zhì)試樣5.0 g,置50 mL 離心管中,加入20 mL 0.1 mol/L 的EDTA-Mcllvaine 緩沖液,1000 r/min渦旋混合1 min,超聲提取10 min,10 000 r/min 離心5 min(溫度低于5℃),提取3 次,合并上清液。凈化:將提取的上清液以2~3 mL/min 的速度過(guò)HLB 固相萃取柱(200 mg,6 mL),棄去濾液,用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗,棄去淋洗液,將小柱抽干,再用6 mL 甲醇洗脫并收集洗脫液,洗脫液用氮?dú)獯蹈桑? mL 0.2%甲酸水溶液溶解,即得]。實(shí)驗(yàn)中分別考察了水、甲醇、乙腈作為提取溶劑,超聲與渦旋兩種提取方式。經(jīng)提取條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)選用水提取,加入1%乙酸乙腈除去蛋白,加乙腈飽和的正己烷脫脂凈化后,各被測(cè)成分峰形較好,提取率較高。
本研究建立了LC-MS/MS 法測(cè)定甲狀腺片中7 種喹諾酮類(lèi)藥物的殘留的方法,該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、專(zhuān)屬性好,可用于甲狀腺片中喹諾酮類(lèi)藥物殘留的質(zhì)量控制。