秦振英 仲逢鈺 陳 瑤 李 婧 楊 梓 文 娟 王玉美 胡幼芳

1.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，江蘇省婦幼保健院兒童保健科，江蘇南京 210036；2.南京醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇南京 210029；3.南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院醫(yī)學研究中心，江蘇南京 210004；4.揚州大學醫(yī)學院附屬淮安市婦幼保健院新生兒疾病篩查科，江蘇淮安 223302

近年來，超重/肥胖發(fā)生率逐年上升[1]，呈明顯低齡化趨勢，不僅影響兒童生長發(fā)育，且成年后罹患多種代謝性疾病的風險也相應增加[2]。作為機體重要的代謝儲能器官，脂肪組織還可分泌諸多炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、抵抗素、脂連素、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等[3]，加之后天靜坐少動、膳食結構改變等環(huán)境因素影響[4]，造成脂肪組織過多異常積聚，脂源性細胞因子的分泌及作用出現(xiàn)異常，誘發(fā)了肥胖相關胰島素抵抗的發(fā)生并加劇其進展[5]。

微小RNA（miRNA），一類新型內分泌因子，通過抑制翻譯或降解靶標mRNA 對基因表達進行調控，參與能量代謝調節(jié)[6]、胰島素抵抗[7-8]、腫瘤發(fā)生[9]等病理生理過程。本研究小組前期發(fā)現(xiàn)，miR-506 在正常與肥胖患者脂肪組織中差異表達，進一步生物信息學及靶基因富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-506 與胰島素抵抗、脂肪細胞因子、胰腺癌等多個信號轉導通路有關。而目前有關miR-506 主要集中于腫瘤性疾病的研究[10-11]。本研究擬探討脂源性炎癥因子（TNF-α、IL-6）對人脂肪細胞中miR-506 表達的調控作用，為闡明其在肥胖相關胰島素抵抗和炎癥反應中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人前體脂肪細胞系（HPA-v），購自美國Science Cell 公司。

1.2 脂肪細胞培養(yǎng)及誘導分化

人前體脂肪細胞，在37℃、5%CO2孵箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）中培養(yǎng)，以含5%胎牛血清的人脂肪細胞培養(yǎng)基（美國Science Cell 公司，No.7211）培養(yǎng)人脂肪前體細胞，按1×105個/mL 密度接種于6 孔板中，待細胞貼壁生長至完全融合并使細胞接觸抑制48 h 后開始誘導分化，培養(yǎng)液換用含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（MIX，美國Sigma 公司，No.I7018）0.5 mmol/L、地塞米松（美國Sigma 公司，No.50-02-2）1 μmol/L、胰島素（美國Sigma 公司，No.I2643）5 μg/mL 和羅格列酮（美國Sigma 公司，No.R2408）1 μmol/L 的DMEM/F12的無糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，No.12400-024）。培養(yǎng)4 d 后換用含5 μg/mL 胰島素的DMEM/F12 無糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3 天換液1 次，直至第15 天，采用油紅“O”（美國Sigma 公司，No.O8010）染色法驗證分化成熟度。

1.3 實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（qRT-PCR）技術檢測人成熟脂肪細胞中miR-506 的表達情況

將人脂肪前體細胞接種于6 孔板中，誘導分化為成熟脂肪細胞。細胞于實驗前1 d 更換為無血清無糖的DMEM/F12 培養(yǎng)基饑餓刺激過夜，后分別以含濃度為10、30 ng/mL 的TNF-α（美國Sigma 公司，No.T6674）、IL-6（美國Sigma 公司，No.KX-GMP-027）的DMEM/F12 無糖培養(yǎng)基干預0、4、8、24 h。分別收取各時間點不同濃度的脂肪細胞，-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?。具體如下：Trizol（美國Invitrogen 公司，No.15596026）法提取脂肪細胞中總RNA，按照逆轉錄試劑盒（日本TAKARA 公司，No.RR037A）說明書進行逆轉錄，所用引物序列由廣州銳博生物技術有限公司提供。采用SYBRGreen PCR 試劑盒（美國KAPA Biosystems 公司，No.KK4601）定量擴增體系進行反應。反應總體積10 μL：cDNA 1 μL，引物0.5 μL，SYBR Primix Ex TaqTM2 μL，加RNase H2O 至10 μL。其中PCR 擴增條件：50℃預變性20 min，95℃變性2 min，95℃15 s，60℃60 s，40 個循環(huán)。應用2-△△CT方法計算表達量。分別與0 h比較，計算藥物干預4、8、24 h 后miR-506 的相對表達量。所有實驗均獨立重復操作至少3 次。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8 及SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計量資料數(shù)據用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人脂肪細胞分化過程中形態(tài)學的變化

顯微鏡下見人脂肪細胞中脂滴豐富，約85%以上的細胞分化成熟，提示本實驗誘導分化方案切實可行。見圖1。

圖1 人脂肪細胞分化形態(tài)圖（200×）

2.2 人脂肪細胞分化過程中miR-506 的表達情況

qRT-PCR 結果顯示，分化成熟脂肪細胞中miR-506 表達量高于前體脂肪細胞，差異有高度統(tǒng)計學意義（t=8.07，P <0.01）。見圖2。

圖2 人脂肪細胞分化過程中miR-506 的表達情況

2.3 TNF-α 作用時間及濃度變化對人脂肪細胞miR-506表達水平的影響

10 ng/mL 的TNF-α 干預成熟人脂肪細胞4、8、24 h miR-506 表達量與干預0 h 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05）。30 ng/mL 的TNF-α 干預成熟人脂肪細胞24 h miR-506 表達量高于干預0 h，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.42，P <0.05）。見圖3。

2.4 IL-6 作用時間及濃度變化對人脂肪細胞miR-506 表達水平的影響

圖3 TNF-α 作用時間及濃度變化對人脂肪細胞miR-506 表達水平的影響

10 ng/mL 的IL-6 干預成熟人脂肪細胞4、8、24 h miR-506 表達量與干預0 h 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05）。30 ng/mL 的IL-6 干預成熟人脂肪細胞24 h miR-506 表達量高于干預0 h，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.91，P <0.05）。見圖4。

3 討論

圖4 IL-6 作用時間及濃度變化對人脂肪細胞miR-506 表達水平的影響

肥胖癥是由于長期能量攝入超過機體消耗，導致體內脂肪過度異常積聚的一種常見的營養(yǎng)障礙性疾病。研究顯示[5,12-13]，肥胖時脂肪組織分泌的TNF-α、IL-6 等細胞因子介導的慢性炎癥是引起肥胖相關胰島素抵抗、代謝綜合征等相關疾病的重要因素。肥胖及其相關疾病病因機制復雜，近年來諸多研究顯示，肥胖、胰島素抵抗及miRNA 之間有著密切的聯(lián)系[6-8,14]。

miRNA 是真核生物體內發(fā)現(xiàn)的一類高度保守且具有調控功能的非編碼RNA 分子。有文獻綜述顯示[14]，與正常對照組比較，肥胖患者循環(huán)中有33 個miRNA表達異常，進一步生物信息學分析顯示這些miRNA相關靶基因功能涉及脂肪酸的代謝以及胰島素的信號傳導。Cui 等[15]篩選了肥胖兒童及2 型糖尿病成年患者循環(huán)中數(shù)個差異表達的miRNA 并在肥胖及胰島素抵抗模型小鼠中進行驗證后發(fā)現(xiàn)，miR-486、miR-146b、miR-15b 可作為預測肥胖兒童成年后發(fā)生2 型糖尿病風險的標志物。本研究小組前期實驗發(fā)現(xiàn)，miR-506 在肥胖患者脂肪組織中差異表達，進一步細胞學實驗發(fā)現(xiàn)，成熟人脂肪細胞中miR-506 表達明顯高于前體脂肪細胞；且靶基因富集分析顯示，miR-506與胰島素抵抗、脂肪細胞因子等多個信號通路有關，提示其可能與肥胖及肥胖相關胰島素抵抗有關。本研究擬探討脂源性細胞因子（TNF-α、IL-6）刺激誘導脂肪細胞胰島素抵抗狀態(tài)下miR-506 的表達情況。

人體脂肪組織是促炎細胞因子的主要來源之一，在肥胖及胰島素抵抗個體中TNF-α、IL-6 水平明顯升高，且與肥胖和胰島素抵抗的程度相關[16-18]。TNF-α可直接抑制胰島素信號轉導通路中關鍵蛋白胰島素受體底物-1（IRS-1）的酪氨酸磷酸化水平[19]、降低胰島素敏感細胞膜上葡萄糖轉運蛋白4 的表達水平[12]，或間接抑制PI3K-AKT 胰島素信號轉導通路[20]，最終導致胰島素抵抗的發(fā)生。如分別以10、20 ng/mL 的TNF-α 干預96 h[12]和24 h[21]，可引起3T3-L1 脂肪細胞胰島素抵抗的發(fā)生。以TNF-α 干預成熟人脂肪細胞也可引起胰島素抵抗相關miRNA 的表達異常[22-23]。綜上，本研究以10、30 ng/mL 的TNF-α 干預成熟人脂肪細胞結果顯示，10 ng/mL 的TNF-α 干預成熟人脂肪細胞4、8、24 h miR-506 表達量與干預0 h 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05）；30 ng/mL 的TNF-α干預成熟人脂肪細胞24 h miR-506 表達量高于干預0 h，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）。IL-6 也是肥胖相關胰島素抵抗發(fā)生的重要細胞因子，IL-6 慢性失衡可引起胰島素受體及IRS-1 的磷酸化受損，或激活炎癥信號通路交互抑制胰島素的信號傳導[13,24]。如20 ng/mL 的IL-6 處理脂肪細胞24 h 明顯降低胰島素刺激后IRS-1 酪氨酸磷酸化活性[19]；亦有研究顯示[25],100～200 ng/mL 的IL-6 可直接調控脂肪細胞中胰島素受體信號轉導相關的細胞因子抑制因子3 的表達，通過多種直接或間接途徑影響胰島素靶細胞正常發(fā)揮作用，從而引發(fā)胰島素抵抗。30 ng/mL 的IL-6干預人脂肪細胞48 h 可通過調控相關miRNA 的表達來影響脂肪細胞胰島素的敏感性[23]。本研究進一步以10、30 ng/mL 的IL-6 干預成熟人脂肪細胞，結果顯示，10 ng/mL 的IL-6 干預成熟人脂肪細胞4、8、24 h miR-506 表達量與干預0 h 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05）；30 ng/mL 的IL-6 干預成熟人脂肪細胞24 h miR-506 表達量高于干預0 h，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）。本研究結果提示miR-506 表達水平的變化可能與TNF-α、IL-6 誘導的炎癥反應和胰島素抵抗有關，為miR-506 進一步的功能研究提供理論依據。

肥胖與胰島素抵抗密切相關，脂肪組織的慢性炎癥是肥胖和胰島素抵抗的中間橋梁。本研究結果初步提示，miR-506 的表達受到多種肥胖和胰島素抵抗相關細胞因子的調控，可能與肥胖相關胰島素抵抗的發(fā)生有關，具體機制有待進一步探討。