畢英杰，謝晶瑩，許淑娟，鄧盈盈，李倬，馮若飛

1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070

腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）于1945 年由HELWIG 和SCHMIDT 于佛羅里達(dá)州邁阿密首次分離［1］，1958 年，巴拿馬報(bào)道 EMCV 可感染豬并引起致死性心肌炎［2］。我國(guó)于2005 年首次分離獲得EMCV，命名為BJC3［3］。該病毒屬小RNA 病毒科，心病毒屬，是無(wú)囊膜單股正鏈RNA 病毒，病毒衣殼為直徑30 nm 的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，每個(gè)衣殼由 VP1、VP2、VP3 和 VP4 4 種結(jié)構(gòu)蛋白組成［4］。該病毒可致仔豬致死性心肌炎及懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎與木乃伊胎，給各國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失［5］。

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白2（interferon induced transmembrane proteins 2，IFITM2）是干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族成員之一，1984 年，F(xiàn)RIEDMAN 等［6］通過(guò) cDNA文庫(kù)篩選，在經(jīng)干擾素治療的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中鑒定出IFITM 基因。目前，已在人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5 和 IFITM10，其基因位于 11 號(hào)染色體上［7］，其中IFITM2 主要位于細(xì)胞內(nèi)相關(guān)區(qū)室，但具體位置尚未明確［8］。有研究證明，IFITM 是一種內(nèi)源性限制因子，可抑制甲型流感病毒和登革熱病毒［9］，其抗病毒作用廣泛，包括西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、埃博拉病毒（ebola virus，EBOV）、馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、人類免疫缺陷病毒1 型（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）、黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）、水泡性口炎病毒（vesicular stoma-titis virus，VSV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）等［10-15］。本研究通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IFITM2，在 HEK293 細(xì)胞中探討 IFITM2 對(duì) EMCV 感染的影響，為后續(xù)其作用機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株、病毒、質(zhì)粒及基因序列 HEK293細(xì)胞、BHK-21 細(xì)胞、感受態(tài) E.coli BL21、EMCV 毒株P(guān)V21 及空載體pcDNA3.1 均由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供；靶向IFITM2 的siRNA 序列（siRNA001 序列為：5′-ACCACATTGTGCAAACCTT-3′，siRNA002 序列為：5′-CCAACTACGAGATGCTCAA-3′，siRNA003 序列為：5′-CCATTCTGCTCATCATCAT-3′）及對(duì)照序列siRNANC 均由廣州瑞博生物科技公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 主要試劑 胰蛋白酶、DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基及新生牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；重組人干擾素 α-2a（recombinant human interferon alpha-2a，IFNα-2a）購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥集團(tuán)；細(xì)胞總RNA 提取試劑盒 RNAiso plus、LA-Taq 聚合酶及 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自日本TaKaRa 公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega 公司；SYBR Select Master Mix購(gòu)自美國(guó)AppliedBiosystems 公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；Opti-MEM 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；鼠抗β-actin 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；兔抗IFITM2 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠及山羊抗兔IgG 購(gòu)自美國(guó)Jackson 公司；Trans-Blot Turbo Mini-size Transfer Stacks 及 Hyper Singal 高敏 ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司；RIPA細(xì)胞裂解液及PMSF 蛋白保護(hù)劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將液氮保存的HEK293 及BHK-21細(xì)胞于37 ～40 ℃溫水中快速溶解，300× g 離心10 min；棄上清，加入1 mL 含10% NBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank 中登錄的人源IFITM2 基因序列（NM_006435），應(yīng)用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)基因引物，F(xiàn)：5′-GGGGATCCATGAACCACATTGTGCAAAC-3′（下劃線部分為BamHⅠ酶切位 點(diǎn)），R：5′-GGGAATTCCTATCGCTGGGCCTGGACGA-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增產(chǎn)物大小為439 bp。引物由西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司合成。參考文獻(xiàn)［16］方法構(gòu)建人源IFITM2 重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-IFITM2。

1.5 HEK293 細(xì)胞中IFITM2 過(guò)表達(dá)情況的檢測(cè)在LipofectamineTM2000 的介導(dǎo)下，將重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IFITM2 及空載體 pcDNA3.1 轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞中，于37 ℃轉(zhuǎn)染 24 h 后，收集 HEK293細(xì)胞，按RNAiso plus 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火34 s，共40 個(gè)循環(huán)。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，RIPA 裂解，經(jīng)15% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用2.5% 脫脂奶粉于室溫封閉1 h；TBST洗滌 3 次，加入兔抗 IFITM2 多克隆抗體（1 ∶3 000稀釋）及鼠抗 β-actin 單克隆抗體（1 ∶5 000 稀釋），于 4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌3 次，加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗鼠IgG（1 ∶10 000 稀釋），室溫孵育1 h；ECL 法顯色。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染）。

1.6 IFITM2 過(guò)表達(dá)對(duì)EMCV 增殖影響的檢測(cè) 在LipofectamineTM2000 的介導(dǎo)下，將重組表達(dá)質(zhì)粒pc-DNA3.1-IFITM2 和空載體pcDNA3.1 轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，于 37 ℃培養(yǎng) 24 h；按 100 TCID50的 EMCV 感染 HEK293 細(xì)胞，37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育 2 h；棄培養(yǎng)液，加入含3% NBS 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；-80 ℃反復(fù)凍融 3 次；于 4 ℃，5 000 × g離心10 min，取培養(yǎng)上清，參照文獻(xiàn)［17］方法檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，TCID50法檢測(cè)病毒滴度。

1.7 HEK293 細(xì)胞中IFITM2抑制效果的檢測(cè) 在LipofectamineTM2000 的介導(dǎo)下，將 siRNA（siRNA001、siRNA002、siRNA003）及 siRNANC 序列轉(zhuǎn)染至 HEK-293 細(xì)胞（預(yù)先經(jīng) 2 000 IU ／ mL IFNα2a 刺激 12 h），于37 ℃培養(yǎng)24 h。采用qPCR 法及Western blot 法檢測(cè)干擾效果，方法同1.5 項(xiàng)。

1.8 IFITM2 下調(diào)對(duì)EMCV 體外增殖影響的檢測(cè)將抑制IFITM2表達(dá)的HEK293 細(xì)胞進(jìn)行EMCV 感染，并檢測(cè)子代病毒的病毒拷貝數(shù)和病毒滴度，方法同 1.6 項(xiàng)。

1.9 IFITM2 過(guò)表達(dá)對(duì)EMCV 吸附影響的檢測(cè)HEK293 細(xì)胞長(zhǎng)滿至單層，在LipofectamineTM2000 的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IFITM2，轉(zhuǎn)染24 h 后，按 MOI = 3 接種 EMCV，4 ℃孵育 2 h；用預(yù)冷的1 × PBS 洗去未結(jié)合的病毒粒子，收集細(xì)胞，提取總RNA，參照文獻(xiàn)［17］方法檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，即為吸附的病毒粒子數(shù)。

1.10 IFITM2 過(guò)表達(dá)對(duì)EMCV 進(jìn)入影響的檢測(cè)HEK293 細(xì)胞長(zhǎng)滿至單層，在LipofectamineTM2000 的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IFITM2，轉(zhuǎn)染24 h 后，按 MOI = 3 接種 EMCV，4 ℃孵育 2 h；用預(yù)冷的1 × PBS 洗去未結(jié)合的病毒粒子，加入3% NBS DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃孵育 2 h；棄培養(yǎng)上清，1 × PBS洗滌細(xì)胞，收集細(xì)胞，提取RNA，參照文獻(xiàn)［17］方法檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，即為進(jìn)入的病毒粒子數(shù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用T-tests 及One-way ANOVA 方法，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 IFITM2 基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)439 bp 的目的基因片段，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IFITM2 的雙酶切（BamHⅠ／ EcoRⅠ）產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)約439 和5 428 bp 的目的基因片段及載體片段，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段與NCBI原始序列同源性為100%。表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IFITM2 構(gòu)建正確。

圖1 IFITM2 基因PCR 產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of IFITM2 gene

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IFITM2 的雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pcDNA3.1-IFITM2（BamHⅠ／ EcoRⅠ）

2.3 HEK293 細(xì)胞中IFITM2 的過(guò)表達(dá) pcDNA3.1-IFITM2 組、pcDNA3.1 組和空白對(duì)照組 HEK293 細(xì)胞IFITM2 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分別為 1 478.220 00、1.057 50、1.004 24，蛋白表達(dá)水平分別為1.80、1.14、1.00。 pcDNA3.1-IFITM2 組 HEK293 細(xì)胞IFITM2 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平均明顯高于pcDNA3.1 組和空白對(duì)照組（F = 1.013，P <0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot 法檢測(cè)過(guò)表達(dá)IFITM2 蛋白的水平Fig.3 Determination of overexpression level of IFITM2 by Western blot

2.4 過(guò)表達(dá)IFITM2 對(duì)EMCV 體外增殖的影響pcDNA3.1-IFITM2 組及pcDNA3.1 組病毒粒子拷貝數(shù)分別為 1.614 51 × 105和 5.068 77 × 106，病毒滴度分別為 10-5.67和 10-6.68TCID50／ mL。pcDNA3.1-IFITM2 組的病毒粒子拷貝數(shù)及病毒滴度均顯著低于 pcDNA3.1 組（t 分別為 7.32 和 16.83，P 分別＜0.001 及＜0.05）。表明過(guò)表達(dá)IFITM2 可抑制EMCV在HEK293 細(xì)胞中的增殖。

2.5 HEK293 細(xì)胞中IFITM2 的抑制效果 siRNA001、siRNA002、siRNA003 及 siRNANC 組 HEK293 細(xì)胞中IFITM2 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分別為0.39、0.42、0.38、1.00，IFITM2 蛋白表達(dá)水平分別 0.36、0.32、0.28、1.00，見(jiàn)圖4。siRNA001、siRNA002、siRNA003組HEK293 細(xì)胞中IFITM2 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平均明顯低于siRNANC 組（F = 131.2，P ＜ 0.001）。表明靶向 IFITM2 的 siRNA 可有效干擾IFITM2 基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，3 種siRNA 序列的干擾效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.024，P ＞ 0.05），因此，用其混合液（siRNAMix）和siRNANC 分別轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 Western blot 法檢測(cè) HEK293 細(xì)胞中 IFITM2 的抑制情況Fig.4 Western blotting of IFITM2 inhibition in HEK293 cells

2.6 IFITM2 下調(diào)對(duì)EMCV 體外增殖的影響 si-RNAMix 組和siRNANC 組病毒粒子拷貝數(shù)分別為1.23 × 106和 6.38 × 104，病毒滴度分別為 10-7.79和10-6.11TCID50／ mL。siRNAMix 組的病毒粒子拷貝數(shù)及病毒滴度均明顯高于siRNANC 組（t 分別為8.193 和 5.622，P 均 ＜ 0.001）。提示 HEK293 細(xì)胞中敲低IFITM2 可顯著促進(jìn)EMCV 增殖。

2.7 IFITM2 過(guò)表達(dá)對(duì)EMCV 吸附及進(jìn)入的影響pcDNA3.1-IFITM2 組與pcDNA3.1 組的吸附病毒粒子數(shù)分別為 3.303 × 105和 3.440 × 105，進(jìn)入病毒粒子數(shù)分別為1.38×106和3.45×106。pcDNA3.1-IFITM2 組與pcDNA3.1 組的吸附病毒粒子數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.499 8，P ＞ 0.05），pcDNA3.1-IFITM2 組的進(jìn)入病毒粒子數(shù)明顯低于pcDNA3.1組（t=7.026，P ＜ 0.01）。表明 IFITM2 蛋白對(duì) EMCV的吸附過(guò)程無(wú)影響，但可有效抑制病毒的進(jìn)入過(guò)程。

3 討 論

先天性免疫是機(jī)體抵抗病毒感染的第一道防線，干擾素作為重要的抗病毒因子，具有廣譜抗病毒作用。病毒感染機(jī)體后激活宿主先天免疫，進(jìn)而產(chǎn)生大量炎癥因子和干擾素刺激基因，發(fā)揮抗病毒作用。有報(bào)道表明，IFITM2 作為干擾素刺激基因的一種，可抑制多種病毒復(fù)制［18］。本研究結(jié)果表明，HEK293 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)IFITM2 可顯著抑制EMCV增殖（P ＜ 0.05），同時(shí)下調(diào) IFITM2 后可促進(jìn) EMCV的增殖（P ＜ 0.001），IFITM2 對(duì) EMCV 的抑制主要發(fā)生在病毒感染早期的進(jìn)入過(guò)程，對(duì)吸附過(guò)程無(wú)影響。

早期研究發(fā)現(xiàn)，IFITM2 和IFITM3 可限制HIV-1的進(jìn)入［19］，同時(shí)IFITM2 還可通過(guò)阻止病毒膜與核內(nèi)體融合，從而限制裂谷熱病毒（rift Valley fever virus，RVFV）的感染［20］；有研究通過(guò)進(jìn)行單個(gè)病毒顆粒融合測(cè)定，表明IFITM 還可抑制內(nèi)體中融合孔的形成，阻止內(nèi)體中的病毒-細(xì)胞融合［21］，由此推測(cè)IFITM2抑制病毒增殖可能是通過(guò)抑制膜融合發(fā)揮作用。

另外，IFITM2 不僅可抑制RNA 病毒的復(fù)制，還可抑制DNA 病毒復(fù)制。有研究指出，IFITM2 可抑制PRV 在PK15 細(xì)胞中的復(fù)制，通過(guò)膽固醇途徑發(fā)揮作用［22］；對(duì)非洲豬瘟病毒（african swine fever virus，ASFV）的相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，IFITM2 可通過(guò)改變膜融合和內(nèi)體膽固醇含量抑制病毒進(jìn)人［23］。本研究表明，IFITM2 可抑制EMCV 在HEK293 細(xì)胞中的增殖，抑制病毒進(jìn)入。結(jié)合上述研究結(jié)果推測(cè)，IFITM2 抑制病毒增殖可能與膜融合相關(guān)。本研究為后續(xù)深入研究IFITM2 抗病毒的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為相應(yīng)抗病毒藥物研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。