劉晶晶 綜述，李玉華 審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院蟲媒病毒疫苗室，北京102629

隨著疫苗在全球范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用，已徹底消滅了天花，脊髓灰質(zhì)炎、麻疹和風(fēng)疹也有望在將來(lái)被消除，多種感染性疾病得到有效控制。但這些疫苗仍存在一些問(wèn)題亟待解決，如滅活疫苗的病毒滅活不徹底和減毒活疫苗的回復(fù)突變，可能引起人為的病毒感染；病毒培養(yǎng)的細(xì)胞基質(zhì)未有效去除，可能引起毒性和炎癥反應(yīng)；產(chǎn)業(yè)化規(guī)模受病毒、細(xì)胞基質(zhì)等因素的限制。而近些年發(fā)展的亞單位疫苗，需添加佐劑才能增強(qiáng)免疫應(yīng)答水平，且很難誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答［1］。傳統(tǒng)疫苗和亞單位疫苗的局限性促進(jìn)了新型疫苗的開發(fā)。

mRNA 疫苗作為新型疫苗的研究方向之一，在短短30 年里，其疫苗平臺(tái)已基本建立起來(lái)。與其他類型疫苗相比，mRNA 疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：mRNA本身不具備感染性，不能整合入宿主細(xì)胞的基因組中，且在其完成蛋白的翻譯后會(huì)自發(fā)降解，不存在感染或基因突變的風(fēng)險(xiǎn)；其次，mRNA 不需要進(jìn)入細(xì)胞核，僅需完成一次跨膜，使抗原的表達(dá)更加迅速［2］；再次，mRNA 通過(guò)設(shè)計(jì)、合成的方法即可完成體外的大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化周期短，有利于傳染病的防控。本文對(duì)mRNA 的構(gòu)建、遞送系統(tǒng)和目前的臨床研究等作一綜述。

1 mRNA 構(gòu)建

目前，mRNA 的構(gòu)建策略有兩個(gè)方向：非復(fù)制型mRNA（nonamplifying mRNA）和自我復(fù)制型mRNA（self-amplifying mRNA，SAM）［3］，見圖1。RNA 在外界環(huán)境中極易降解，從而影響翻譯和表達(dá)效率，非復(fù)制型mRNA 為了穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)、提高表達(dá)效率，以真核細(xì)胞mRNA 的結(jié)構(gòu)為參照，對(duì)mRNA 進(jìn)行了序列修飾。SAM 則是將編碼序列嵌合至帶有RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的載體上，通過(guò)RdRP 對(duì)自身mRNA 的復(fù)制來(lái)提高表達(dá)效率。

圖1 非復(fù)制型mRNA（A）和自我復(fù)制型mRNA（B）Fig.1 Nonamplifying（A）and self-amplifying（B）mRNAs

1.1 非復(fù)制型mRNA

非復(fù)制型 mRNA 的元件包括 5′帽子、3′Poly（A）尾、非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）以及編碼序列。

1.1.1 5′帽子 5′帽子結(jié)構(gòu)是在體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中通過(guò)加帽酶添加至核苷酸的5′端的。最常規(guī)的帽子結(jié)構(gòu)為 7-甲基鳥苷三磷酸（m7G）帽子（Cap0），其能夠防止mRNA 的早期降解，同時(shí)在mRNA 的成熟、運(yùn)輸、起始翻譯過(guò)程中也是至關(guān)重要的。但在加帽過(guò)程中常發(fā)生序列方向的反轉(zhuǎn)，致使1 ／ 3 的mRNA 5′端未形成帽子結(jié)構(gòu)而無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［4］。為了避免帽子序列的方向反轉(zhuǎn)，在Cap0 鳥苷的3′-O 位上甲基化，使其只有1 個(gè)3′-OH 可添加核苷酸，形成防反帽子類似物（anti-reverse cap analog，ARCA），添加ARCA 的mRNA 在蛋白表達(dá)的時(shí)程和水平上均得到了大幅提高［5］。但由于轉(zhuǎn)錄過(guò)程中GTP 的存在，與ARCA 共同競(jìng)爭(zhēng)5′端核苷酸位點(diǎn)，使小部分mRNA形成無(wú)帽結(jié)構(gòu)，從而無(wú)法進(jìn)行下一步翻譯。2′-O 甲基化轉(zhuǎn)錄本的第1 個(gè)核苷形成的帽子（Cap1）同樣可提高蛋白表達(dá)效率，且Cap1 能夠阻止固有免疫對(duì)外源RNA 的清除作用［6］。在甲基化帽子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄本第一核苷形成Cap1 的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定量的Cap0，Cap0 在帽子結(jié)構(gòu)中所占比例直接影響蛋白的表達(dá)效率。

1.1.2 3′Poly（A）尾 Poly（A）尾通過(guò)與多聚腺苷酸結(jié)合蛋白［poly（A）-binding protein，PABP］結(jié)合，降低脫腺苷化速率，穩(wěn)定3′端mRNA 結(jié)構(gòu)，同時(shí)使PABP 與起始轉(zhuǎn)錄因子和5′帽子形成復(fù)合物起到終止翻譯的作用［7］。增加Poly（A）尾的長(zhǎng)度可增強(qiáng)多聚核糖體的形成效率，從而提高蛋白表達(dá)效率。Poly（A）序列一般直接設(shè)計(jì)在mRNA 的質(zhì)粒模板上，隨mRNA 一同進(jìn)行轉(zhuǎn)錄添加到目的基因尾部。研究表明，Poly（A）的適合長(zhǎng)度為 100 ～ 150 個(gè)核苷酸［8-9］。

1.1.3 5′和 3′UTR UTR 是影響 mRNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程的重要反應(yīng)元件，在調(diào)節(jié)mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)與翻譯效率、細(xì)胞器定位和穩(wěn)定mRNA 結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮作用。目前廣泛應(yīng)用的UTR 多為α-和β-球蛋白基因序列，這兩類序列能夠大幅提高RNA 的轉(zhuǎn)錄效率和穩(wěn)定性［10］。除球蛋白序列外，倉(cāng)鼠卵巢延長(zhǎng)因子1-α、人熱休克蛋白70、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosomal entry site，IRES）等序列也被應(yīng)用于 UTR以提高轉(zhuǎn)錄效率［11-12］。

1.1.4 編碼序列修飾 外源RNA 進(jìn)入細(xì)胞可能激活模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptor，PRR）信號(hào)通路，使mRNA 疫苗遭到固有免疫清除而影響免疫效果。對(duì)mRNA 的核苷酸進(jìn)行硫代尿嘧啶、甲基胞嘧啶、假尿嘧啶等化學(xué)修飾可降低固有免疫反應(yīng)［13-14］。另外，對(duì)堿基進(jìn)行編輯優(yōu)化，提高序列中C、G 的比例，可起到提高 mRNA 穩(wěn)定性的作用［15］。但也有研究表明，堿基和核苷酸的改變可能導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，影響蛋白正確折疊和T 細(xì)胞表位暴露，反而降低了免疫效果［16-17］。

1.2 SAM SAM 是一種基于RNA 病毒基因組設(shè)計(jì)的復(fù)制子，目前研究最多的SAM 是以甲病毒屬基因組作為載體進(jìn)行改造的。甲病毒屬基因組為正鏈RNA，由兩部分組成：一部分編碼非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1 ～nsP4，在翻譯過(guò)程中形成復(fù)制復(fù)合體；另一部分編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白和糖蛋白。SAM是將甲病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因替換成特異性的抗原基因，使RNA 失去了組裝成感染性病毒的能力。復(fù)制復(fù)合體參與合成全長(zhǎng)負(fù)鏈RNA，并以其為模板合成重組的基因組RNA 和特異性抗原基因，抗原基因被高水平轉(zhuǎn)錄后翻譯成目的抗原。與非復(fù)制型mRNA疫苗相比，抗原表達(dá)量和持續(xù)時(shí)程均明顯提高［18］。但病毒載體的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）的保守性可能使其反應(yīng)原性難于控制，同時(shí)載體蛋白產(chǎn)生的免疫原性可能導(dǎo)致預(yù)存抗體的形成。

2 遞送系統(tǒng)

RNA 是親水性、帶負(fù)電荷的大分子，其自主跨膜能力有限，因此，如何高效地將mRNA 遞送至細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行抗原表達(dá)，是限制RNA 疫苗應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題之一。WOLFF 等［19］首次將編碼報(bào)告基因的mRNA 注射進(jìn)小鼠體內(nèi)并觀察到了蛋白表達(dá)。但由于RNAase 的存在能使外源RNA 迅速降解，而影響抗原表達(dá)效率。為解決這個(gè)瓶頸問(wèn)題，經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，可使用一種遞送系統(tǒng)協(xié)助mRNA 進(jìn)入細(xì)胞，并能保護(hù)mRNA 不被降解。理想的遞送系統(tǒng)能夠攜帶mRNA 通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜而不被RNase 降解，進(jìn)入細(xì)胞后能夠允許mRNA 釋放到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯，同時(shí)，該遞送系統(tǒng)具有其相應(yīng)的安全性。目前，已有多種策略用于mRNA 的遞送，包括多肽、脂質(zhì)體、聚合物、納米乳劑等。

2.1 魚精蛋白 魚精蛋白是一種由30 個(gè)左右氨基酸殘基組成的陽(yáng)離子多肽，含1 個(gè)核定位信號(hào)（nuclearlocalization signal，NLS），與 mRNA 結(jié)合有利于增強(qiáng)mRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率，另外，還可保護(hù)其免受RNase 降解，同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，起到佐劑的作用［20］。臨床試驗(yàn)已證明了其安全性，并能在一定程度上提高T 細(xì)胞免疫水平［21］。但也有報(bào)道由于魚精蛋白與mRNA 結(jié)合過(guò)于緊密，而使蛋白的表達(dá)效率降低［22］。

2.2 脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs） 脂質(zhì)體已被FDA 批準(zhǔn)用于多種化學(xué)藥物的遞送。隨著對(duì)mRNA 疫苗研究的深入，脂質(zhì)體也成為mRNA 遞送系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)之一，其中，LNPs 是最受關(guān)注的一類脂質(zhì)體遞送工具。通常LNPs 由陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇、磷脂和PEG 4 種成分構(gòu)成，與mRNA 自發(fā)裝配成100 nm 左右的顆粒。陽(yáng)離子脂質(zhì)在pH 為酸性的條件下，通過(guò)電荷相互作用將帶有負(fù)電荷的mRNA包裹進(jìn)LNPs 核心，進(jìn)入細(xì)胞后，在生理pH 條件下使LNPs 的表面呈電中性或弱陽(yáng)性，避免了非特異性脂蛋白的結(jié)合，同時(shí)利于mRNA 釋放入細(xì)胞質(zhì)；膽固醇起到穩(wěn)定LNPs 結(jié)構(gòu)的作用；磷脂則形成保護(hù)性的雙層膜結(jié)構(gòu)，其帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)與陽(yáng)離子脂質(zhì)作用有利于mRNA 在細(xì)胞質(zhì)中的逃逸；PEG延伸到LNPs 外側(cè)，能夠減少與胞內(nèi)蛋白的相互作用，同時(shí)延長(zhǎng)顆粒在體內(nèi)的半衰期［23］。有文獻(xiàn)報(bào)道，合成的LNPs 的組成成分、所帶電荷、顆粒直徑及顆粒排布等直接影響疫苗的藥代動(dòng)力學(xué)特性和免疫效果［24］。

2.3 高分子聚合物 聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）是用于基因遞送常見的聚合物。PEI 的分子量通常有幾十個(gè)KDa，是遞送同樣大分子的SAM 最適宜的載體之一。但PEI 的高分子量也帶來(lái)了高的細(xì)胞毒性［25］，為了解決這一問(wèn)題，研究者對(duì)PEI 進(jìn)行了化學(xué)修飾，在低分子量的PEI 支鏈上添加了β-環(huán)糊精，可通過(guò)鼻滴的方式幫助mRNA 穿過(guò)上皮細(xì)胞屏障到達(dá)淋巴組織［26］。

2.4 納米乳劑 Novartis 公司研制了一種用于遞送SAM 的納米乳劑，該乳劑是在其公司專利人用疫苗佐劑MF59 的基礎(chǔ)上添加DOTAP 等油相成分，以包裹水相中的mRNA 來(lái)達(dá)到遞送的目的。在小鼠、兔和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物試驗(yàn)中，兩次肌注后均獲得了高水平的中和抗體［27］。但由于其包含水、油兩種不相溶的成分，穩(wěn)定性較差，包裹RNA 后很難形成小而均一的結(jié)構(gòu)。

在脂質(zhì)載體中，陽(yáng)離子脂質(zhì)在細(xì)胞遞送、內(nèi)涵體逃逸中起關(guān)鍵作用，同時(shí)該成分也存在著明顯的細(xì)胞毒性問(wèn)題。陽(yáng)離子脂質(zhì)可作為去垢劑破壞細(xì)胞膜的完整性，當(dāng)其濃度達(dá)到一定程度時(shí)，可誘發(fā)細(xì)胞裂解和細(xì)胞壞死，濃度低時(shí)也有可能影響基因表達(dá)而加快細(xì)胞凋亡。在動(dòng)物肝臟富集時(shí)，通過(guò)觸發(fā)炎性因子從而破壞肝臟功能，濃度過(guò)高還可能引起小鼠死亡。近些年，已從幾方面對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)進(jìn)行了優(yōu)化，在保證遞送效率的同時(shí)降低細(xì)胞毒性。如對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造、修飾，將陽(yáng)離子替換成可電離的離子，篩選低毒性陽(yáng)離子脂質(zhì)等。

3 mRNA 疫苗的應(yīng)用

3.1 流感疫苗 流感疫苗是首個(gè)嘗試將mRNA 用于疾病預(yù)防的疫苗［28］。由于流感病毒的血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）極易發(fā)生變異，尚無(wú)廣譜性疫苗可對(duì)抗突變的病原體，因此，建立一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單、快速產(chǎn)業(yè)化的疫苗平臺(tái)有利于應(yīng)對(duì)病毒突變，控制疾病流行。

在非復(fù)制型 mRNA 方面，PETSCH 等［28］將 A ／Puerto Rico ／ 8 ／ 34（H1N1）株流感病毒的 HA 全長(zhǎng)序列與魚精蛋白形成的復(fù)合物經(jīng)皮下免疫小鼠，獲得了穩(wěn)定、長(zhǎng)效的免疫保護(hù)作用，采用另一株流感病毒的HA 序列設(shè)計(jì)的mRNA 疫苗免疫白釉和豬，同樣獲得了與已上市滅活疫苗類似的免疫保護(hù)效果。LUTZ 等［29］利用 Curevac AG 公司建立的 RNActive平臺(tái)，構(gòu)建了 A ／ Netherlands ／ 602 ／ 2009（H1N1）HA的mRNA-LNPs，經(jīng)肌肉免疫非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，HAI滴度在1 年內(nèi)均保持很高的水平（≥ 1 ∶60）；構(gòu)建的A ／ HongKong ／ 4801 ／ 2014（H3N2）HA 的 mRNALNPs 誘導(dǎo)的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞免疫應(yīng)答水平甚至優(yōu)于已上市的MF59 佐劑疫苗。Modena TX 公司的mRNA-LNPs 率先完成了H10N8 和H7N9 流感疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03076385，NCT03345043）［30］，經(jīng)肌肉免疫兩針，間隔3 周，H10N8 的免疫劑量為100 μg 時(shí)，HAI 滴度 ≥ 1 ∶40 的陽(yáng)轉(zhuǎn)率為 100%，MN滴度 ≥ 1 ∶20 的陽(yáng)轉(zhuǎn)率為87.0%；H7N9 的免疫劑量為 25 μg 時(shí)，HAI 滴度 ≥ 1 ∶40 的陽(yáng)轉(zhuǎn)率為 96.3%，MN 滴度 ≥ 1 ∶20 的陽(yáng)轉(zhuǎn)率為100%，兩疫苗均無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)，獲得了良好的免疫耐受和體液免疫效果，但未誘導(dǎo)出細(xì)胞免疫。

在 SAM 方面，HEKELE 等［31］利用 SAM 疫苗平臺(tái)，將 A ／California ／07 ／2009（H1N1）和 A ／Shanghai ／2 ／ 2013（H7N9）HA 的重組 RNA 分別包裹進(jìn) LNPs中，遞送到動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)肌肉注射0.1 μg 即可誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。MAGINI 等［32］合成了 3 種 SAM-LNPs，其中針對(duì)病毒核蛋白（nucleoprotein，NP）的 NP-SAMLNPs 表現(xiàn)出了良好的效果，能誘導(dǎo)出特異性CD4+T和CD8+T 細(xì)胞，并對(duì)小鼠具有一定的交叉保護(hù)作用。該團(tuán)隊(duì)利用另一遞送系統(tǒng)合成了HA-SAM-CNE，也誘導(dǎo)出了細(xì)胞免疫和體液免疫，對(duì)同型病毒具有保護(hù)作用［33］。VOGEL 等［34］采用 PEI 遞送系統(tǒng)對(duì)合成的HA-mRNA-PEI 和HA-SAM-PEI 進(jìn)行了免疫效果的比較，并配伍了 A ／California ／07 ／2009（H1N1）、A ／ Hong Kong ／ 1 ／ 68（H3N2）和 B ／ Massachusetts ／2 ／ 2012 的三價(jià) HA SAM 疫苗，該多價(jià)疫苗能保護(hù)小鼠對(duì)H1N1 和N3N2 型病毒的攻擊。目前尚無(wú)SAM 疫苗進(jìn)入臨床研究階段。

3.2 狂犬病疫苗 狂犬病病毒侵染哺乳動(dòng)物神經(jīng)后的致死率極高，雖已有多種獲批疫苗應(yīng)用于狂犬病的預(yù)防，但價(jià)格和供給限制等因素仍使亞洲、南美洲國(guó)家面臨病毒感染的威脅。mRNA 疫苗生產(chǎn)成本和安全性等優(yōu)勢(shì)使其在未來(lái)獲得更大范圍的推廣成為可能。另外，WHO 評(píng)價(jià)狂犬病疫苗臨床保護(hù)效果的標(biāo)準(zhǔn)已確定，便于mRNA 疫苗與獲批疫苗進(jìn)行有效性的比較［35］。

CureVac AG 公司研制的狂犬病疫苗CV7201已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT02241135）［36］。該疫苗是應(yīng)用與流感疫苗相同的mRNA 疫苗設(shè)計(jì)平臺(tái)，將編碼糖蛋白（RABV-G）的mRNA 與魚精蛋白混合形成復(fù)合物。臨床前研究顯示，該疫苗對(duì)小鼠和豬表現(xiàn)出了良好的免疫原性和保護(hù)效果，皮下免疫效果與已上市的Rabipur 疫苗類似［37］。臨床試驗(yàn)采取了皮下和肌肉兩種免疫方式，共免疫3 次。在安全性評(píng)價(jià)方面，大部分受試者出現(xiàn)了局部或全身不良反應(yīng)，其中有3 例嚴(yán)重不良反應(yīng)，該臨床試驗(yàn)認(rèn)為其安全性在可接受范圍內(nèi)。在有效性評(píng)價(jià)方面，僅皮下無(wú)針注射方式免疫時(shí)陽(yáng)轉(zhuǎn)率可達(dá)76%，第42 天，特異性CD4+T 細(xì)胞增加，免疫效果受免疫方式影響嚴(yán)重。LUTZ 等［29］同時(shí)嘗試?yán)?RNActive 疫苗平臺(tái)構(gòu)建了 RABV-G mRNA-LNPs 疫苗，單次免疫 0.5 和 5 μg，小鼠可100%陽(yáng)轉(zhuǎn)，且CD4+、CD8+T 細(xì)胞免疫也達(dá)較高水平；單次免疫10 μg，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物也達(dá)到類似的免疫效果，該候選疫苗已進(jìn)入Ⅰ期臨床入組階段（NCT 03713086）。

3.3 寨卡疫苗 2015 — 2016 年，寨卡病毒在美洲地區(qū)開始大范圍傳播，導(dǎo)致了大量胎兒的先天性畸形等病癥，但無(wú)疫苗可供使用。Modena TX 公司的非復(fù)制型mRNA-LNPs 疫苗已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03014089），結(jié)果尚未發(fā)布；另一針對(duì)黃病毒屬病毒血清陽(yáng)性和陰性人群的Ⅰ期臨床正在入組（NCT04064905）。該疫苗的臨床前研究顯示，對(duì)mRNA進(jìn)行修飾后，免疫 AG129 和 C57BL ／ 6 小鼠，可誘導(dǎo)出強(qiáng)效的中和抗體（EC50可達(dá) 1 ／ 100 000），且無(wú)病毒血癥出現(xiàn)。E-DII-FL 突變的mRNA-LNPs 還能降低感染登革病毒后出現(xiàn)的免疫增強(qiáng)反應(yīng)［38］。PARDI等［39］對(duì)寨卡病毒的prM-E 蛋白序列進(jìn)行了優(yōu)化和假尿嘧啶修飾，合成的mRNA-LNPs 單次免疫小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物均誘導(dǎo)出了高效的中和抗體和持久的保護(hù)力水平。ERASMUS 等［40］將一種新型的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體應(yīng)用于寨卡病毒SAM 的遞送上，單次免疫10 ng 即可使小鼠100%陽(yáng)轉(zhuǎn)，單次免疫3 ng即可達(dá)100%的保護(hù)。ZHONG 等［41］直接將寨卡病毒SAM 通過(guò)皮下電穿孔的方式免疫小鼠，1 μg 即可使 BALB ／ c 和 IFNAR1- ／ -C57BL ／ 6 小鼠產(chǎn)生有效的體液和細(xì)胞免疫，但對(duì)野生C57BL ／ 6 小鼠表現(xiàn)出較低的陽(yáng)轉(zhuǎn)率和抗體滴度。

3.4 新型冠狀病毒疫苗 隨著2019 年底多例不明原因的肺炎病例被報(bào)道，新型冠狀病毒SARS-nCoV-2 迅速在世界范圍內(nèi)開始傳播，截止至2021 年4 月，已有超過(guò)1 億人口被確診，造成至少200 萬(wàn)人死亡［42］，給全球經(jīng)濟(jì)、社會(huì)發(fā)展帶來(lái)了巨大的打擊。多個(gè)國(guó)家采用多種技術(shù)平臺(tái)以前所未有的速度開始了該疫苗的研發(fā)。

Moderna TX 公司利用已有的mRNA 技術(shù)平臺(tái)研制出第一個(gè)進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)的新冠疫苗（NCT04283461），該疫苗的mRNA 編碼新冠病毒全長(zhǎng)S蛋白序列，遞送系統(tǒng)為L(zhǎng)NPs，SM-102 作為其陽(yáng)離子脂質(zhì)成分。Ⅰ期臨床共入組105 名受試者，主要考察其安全性和反應(yīng)原性，以及通過(guò)檢測(cè)IgG 抗體考察其免疫原性。德國(guó)Biontech SE 公司的mRNA-LNPs疫苗緊隨其后分別在德國(guó)和美國(guó)進(jìn)入Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT04368728）。該臨床試驗(yàn)預(yù)計(jì)入組7 600名受試者，分3 個(gè)階段進(jìn)行不同規(guī)模的臨床試驗(yàn)，通過(guò)血清中和抗體、S 蛋白特異性結(jié)合抗體和RBD特異性結(jié)合抗體水平考察其安全性、耐受性、免疫原性及效價(jià)等。中國(guó)在應(yīng)對(duì)新冠病毒疫情時(shí)采用的疫苗研發(fā)5 種技術(shù)策略也包括了新冠病毒mRNA疫苗，該疫苗目前處于研發(fā)之中。

3.5 其他疫苗 還有多種mRNA 疫苗在臨床前及臨床研究階段也取得了較好的結(jié)果。Modena TX 公司的人巨細(xì)胞病毒疫苗編碼五聚體復(fù)合物不同亞基（gH、gL、UL128、UL130、UL131A）和糖蛋白 B 的 mRNA分別與LNPs 復(fù)合，形成含有6 種mRNA-LNPs 復(fù)合物的人巨細(xì)胞病毒疫苗，該疫苗免疫小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物均表現(xiàn)出長(zhǎng)效的中和抗體水平，且對(duì)小鼠可誘導(dǎo)出多種抗原的T 細(xì)胞免疫應(yīng)答［43］，目前該疫苗也已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03382405），進(jìn)入Ⅱ期臨床入組階段（NCT04232280）。另外，該公司的另一mRNA 疫苗—人偏肺病毒與3 型副流感病毒聯(lián)合疫苗也剛剛完成了Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03392389），該疫苗接種健康成人后，中和抗體的幾何均值分別在 6 和 3 左右，有望成為其候選疫苗。ROTH 等［44］以Ⅰ型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的多肽序列作為目的抗原序列設(shè)計(jì)的mRNA-LNPs 免疫HLAⅠ類轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NS3、NS4B、NS5 蛋白的多肽能夠誘導(dǎo)出CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答，且對(duì)Ⅰ型登革病毒攻擊具有保護(hù)作用。MEYER 等［45］研發(fā)的埃博拉病毒糖蛋白mRNA-LNPs 免疫豚鼠后，能產(chǎn)生特異性IgG 抗體和中和抗體，其保護(hù)率達(dá)100%。

4 總結(jié)與展望

隨著新發(fā)突發(fā)傳染病的不斷出現(xiàn)，研發(fā)能夠快速產(chǎn)業(yè)化的疫苗成為新的發(fā)展方向。mRNA 疫苗具有高轉(zhuǎn)染效率、強(qiáng)免疫刺激能力和低感染風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)，近年來(lái)，已在癌癥和HIV 治療等領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，在預(yù)防性疫苗研發(fā)方面雖剛剛起步，但發(fā)展迅速。表達(dá)目的抗原的兩種mRNA 系統(tǒng)，即非復(fù)制型mRNA 和SAM 技術(shù)平臺(tái)的建立具有十分重要的意義。非復(fù)制型mRNA 是在目的抗原序列兩端增加 5′帽子、UTR 和 Poly（A）序列，穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，增加轉(zhuǎn)染效率；SAM 則是在甲病毒屬的非結(jié)構(gòu)序列上插入目的抗原序列，實(shí)現(xiàn)嵌合mRNA 在細(xì)胞內(nèi)的自我復(fù)制。為了提高mRNA 的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性，多種遞送系統(tǒng)的研究得到了發(fā)展，使增加抗原表達(dá)效率、延長(zhǎng)抗原表達(dá)時(shí)間、減少自身炎癥反應(yīng)成為可能。目前，遞送系統(tǒng)仍是mRNA 疫苗研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。在短時(shí)間內(nèi)已有包括流感、狂犬病、寨卡、新冠、人巨細(xì)胞、人偏肺與3 型副流感聯(lián)合疫苗等多種預(yù)防性病毒性疫苗進(jìn)入臨床研究階段，這些候選疫苗均是以非復(fù)制型mRNA 佐以LNPs 或魚精蛋白的策略構(gòu)建，均表現(xiàn)出良好的免疫效果。雖然對(duì)mRNA疫苗的研究時(shí)間尚短，在mRNA 的修飾和設(shè)計(jì)、對(duì)SAM 載體的改進(jìn)、對(duì)遞送系統(tǒng)的選擇和開發(fā)等方面仍有深入研究的廣闊空間，但目前的臨床和臨床前數(shù)據(jù)已展現(xiàn)出積極的研究前景，有望在傳染病防控，尤其是新發(fā)突發(fā)傳染病防控中發(fā)揮重要作用。