張榮，陳婧，黃江濤，呂海龍，楊一邨，王浩斌，張抒

1.成都市第三人民醫(yī)院普外科，四川 成都 610031；2.都江堰市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都 611830

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，由于其發(fā)病率和死亡率不斷升高，已經(jīng)成為全球重大公共健康衛(wèi)生難題之一[1]。全球癌癥最新數(shù)據(jù)顯示，在所有惡性腫瘤中，原發(fā)性肝癌發(fā)病率排名第5位，死亡率排名第2位[2]。我國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)，在我國所有惡性腫瘤中，原發(fā)性肝癌發(fā)病率排名第4位，死亡率排名第3位[3]。由于肝臟解剖結(jié)構(gòu)特殊，原發(fā)性肝癌易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，且常伴有門靜脈癌栓，惡性程度高，預(yù)后非常差[4]。因此，探索原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找準(zhǔn)確可靠的早期診斷和預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)志物，可以實(shí)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的早期診斷、提早治療和干預(yù)，有助于提高病人生存質(zhì)量、改善病人的預(yù)后。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種環(huán)狀的內(nèi)源性非編碼RNA，高度保守，廣泛表達(dá)在人類細(xì)胞中[5]。近年來，有大量文獻(xiàn)報道circRNA在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[6-8]。最近，有文獻(xiàn)報道抑制hsa_circRNA_103809的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞遷移[9]，但臨床尚缺乏hsa_circRNA_103809與原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究報道。因此，本研究對原發(fā)性肝癌病人和健康體檢者血清中的hsa_circRNA_103809進(jìn)行了檢測，探討hsa_circRNA_103809在原發(fā)性肝癌早期診斷和療效預(yù)后評估中的臨床價值。

資料與方法

一、臨床資料

選取2016年6月至2019年6月成都市第三人民醫(yī)院收治的83例經(jīng)病理確診的原發(fā)性肝癌病人設(shè)置為肝癌組，男性44例，女性39例，年齡(61.27±15.43)歲。病人具體病理特征資料見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理確診病人；臨床資料完整；病人知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前采取放化療；合并其他腫瘤；不能耐受手術(shù)或圍手術(shù)期死亡。選取同時期我院健康體檢者75例設(shè)置為健康對照組，男性38例，女性37例，年齡(61.16±14.26)歲。在肝癌組后續(xù)治療的隨訪中，有11例失訪。接受治療且獲得完整臨床資料的72例隨訪對象中，男性38例，女性34例，年齡(60.33±14.45)歲。其中有51例存活病人設(shè)置為存活組，21例死亡病人設(shè)置為死亡組。

所有納入對象無糖尿病、高血壓、慢性阻塞性肺疾病史，無自身免疫性疾病史及免疫抑制藥用藥史，無肝炎、艾滋病等感染病史，排除孕婦和哺乳期婦女。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入對象知情并簽署知情同意書。

二、方法

1.標(biāo)本采集 取病人入院后或手術(shù)2周后清晨空腹肘靜脈血，在4 ℃冰箱中靜置30 min后低速離心(1 500 r/min)20 min，取上清，放入-80 ℃冰箱中保存待用。

2.實(shí)時熒光定量PCR 取出凍存血清，運(yùn)用碧云天生物技術(shù)有限公司的RNA提取試劑盒，按照說明書用硅膠膜離心柱提取總RNA。提取出的總RNA用DEPC處理過的無RNA酶水溶解。運(yùn)用日本Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑，按照說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。運(yùn)用日本Takara公司SYBR試劑進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，按照說明書，反應(yīng)體系總體積20 μL，包括水，1 μL cDNA，SYBR Green I master-mix，0.5 μmol/L的前向和反向引物；反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min，40個循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃，1 min，72 ℃ 30 s)。檢測儀器為Biorad qPCR CFX 96，設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，計(jì)算2-ΔΔCt來檢測hsa_circRNA_103809表達(dá)水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，序列如下：hsa_circRNA_103809上游引物：5′-ACGCATTCTTCGAGACCTCT-3′,下游引物：5′-TGCCTGTAACTCCTCTTCAGT-3′；內(nèi)參GADPH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS(19.0版)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位間距)[M(P25，P75)]表示。正態(tài)分布檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)(K-S檢驗(yàn))，兩組數(shù)據(jù)間比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，治療前后比較用配對t檢驗(yàn)。用GraphPad Prism6軟件繪制受試者工作特征(ROC)曲線，并統(tǒng)計(jì)曲線下面積(AUC)來檢驗(yàn)hsa_circRNA_103809效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

檢測結(jié)果顯示，hsa_circRNA_103809在肝癌組血清中相對表達(dá)量為2.51(1.14，3.87)，在健康對照組血清中相對表達(dá)量為1.14(0.54，1.35)。對比發(fā)現(xiàn)，肝癌組hsa_circRNA_103809表達(dá)水平較健康對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 各組血清中hsa_circRNA_103809相對表達(dá)水平散點(diǎn)圖

原發(fā)性肝癌病人血清hsa_circRNA_103809表達(dá)水平與病人的性別、年齡、甲胎蛋白(AFP)表達(dá)量、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)表達(dá)量和HBV是否陽性無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與腫瘤直徑、有無門靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臟器轉(zhuǎn)移和TNM分期具有明顯相關(guān)性 (P<0.05)。進(jìn)一步分析提示，原發(fā)性肝癌病人腫瘤越大、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有臟器轉(zhuǎn)移、有門靜脈癌栓和TNM分期越高，血清hsa_circRNA_103809表達(dá)水平越高，見表1。

接受手術(shù)治療的原發(fā)性肝癌病人術(shù)前hsa_circRNA_103809相對表達(dá)量為2.56(1.82，3.65)，術(shù)后相對表達(dá)量為1.72(1.38，3.11)，原發(fā)性肝癌病人手術(shù)后hsa_circRNA_103809的表達(dá)水平較手術(shù)前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。手術(shù)后隨訪12個月，分析顯示原發(fā)性肝癌存活組血清hsa_circRNA_103809的相對表達(dá)量為2.13(1.05，3.02)，明顯低于死亡組血清hsa_circRNA_103809的相對表達(dá)量3.21(2.75，3.35)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

表1 hsa_circRNA_103809表達(dá)水平與原發(fā)性肝癌病人臨床病理特征的關(guān)系

圖2 原發(fā)性肝癌病人手術(shù)前后hsa_circRNA_103809相對表達(dá)水平散點(diǎn)圖

ROC曲線分析顯示血清hsa_circRNA_103809表達(dá)水平對原發(fā)性肝癌的診斷效能好，曲線下面積為0.891，診斷臨界值為2.79，特異度達(dá)81.93%，敏感度達(dá)85.33%。(圖4)

圖3 原發(fā)性肝癌術(shù)后存活組和死亡組血清中hsa_circRNA_103809相對表達(dá)水平散點(diǎn)圖

圖4 原發(fā)性肝癌組血清中hsa_circRNA_103809區(qū)別于健康組的診斷效能

討 論

對于疾病研究，生物學(xué)標(biāo)志物一般是指可供客觀測定和評價的生理或病理特征性的生化指標(biāo)，要求具有穩(wěn)定性和重復(fù)性好，特異度和靈敏度高。circRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一種共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，具有高度保守性和特異性表達(dá)的特點(diǎn)，可調(diào)控基因表達(dá)或結(jié)合RNA相關(guān)蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能[10-11]。研究顯示circRNA不受反復(fù)凍融、RNA酶降解的影響，生物學(xué)穩(wěn)定[12-13]，可作為疾病早期診斷、治療和評估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

近幾年來，有越來越多的文獻(xiàn)研究報道，部分circRNA可作為腫瘤早期篩查和預(yù)后評價的標(biāo)志物[14-16]。Yin等[17]通過對比乳腺癌和健康體檢者的circRNA測序數(shù)據(jù)分析確定22個circRNA表達(dá)下調(diào)，19個circRNA表達(dá)上調(diào)，并且他們通過繪制乳腺癌表達(dá)圖譜推測hsa_circRNA_0001785可能是乳腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物。Chen等[18]通過對前列腺癌組織和癌旁組織進(jìn)行測序，結(jié)果顯示有7 232個circRNA與前列腺癌有關(guān)。他們進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)circCSNK1G3可通過與miRNA181結(jié)合促進(jìn)癌細(xì)胞生長增殖，有望作為前列腺癌早期篩查的標(biāo)志物。最近，有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsa_circRNA_103809可以促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生和進(jìn)展[9]，但目前臨床對hsa_circRNA_103809與原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究報道較少。因此，本研究納入了83例病理確診的原發(fā)性肝癌病人和75例健康體檢者，檢測了這些對象血清中hsa_circRNA_103809的表達(dá)，探究其在原發(fā)性肝癌診斷、治療和預(yù)后中的臨床意義。結(jié)果提示原發(fā)性肝癌病人血清中hsa_circRNA_103809的表達(dá)水平顯著高于健康組，且hsa_circRNA_103809的表達(dá)水平與腫瘤直徑、有無門靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臟器轉(zhuǎn)移和TNM分期具有明顯相關(guān)性。同時，我們發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌病人手術(shù)后較手術(shù)前血清中hsa_circRNA_103809的表達(dá)水平前顯著降低。對這些接受手術(shù)的原發(fā)性肝癌病人隨訪1年后，我們還發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌存活組血清hsa_circRNA_103809的表達(dá)水平明顯低于死亡組。這些結(jié)果提示hsa_circRNA_103809可能是原發(fā)性肝癌早期診斷治療和預(yù)后評估的標(biāo)志物。進(jìn)一步的ROC曲線顯示血清hsa_circRNA_103809表達(dá)水平對原發(fā)性肝癌診斷的診斷效能好，特異度和敏感度較高。但值得注意的是，由于本研究納入對象較少且存在部分失訪病人，在后續(xù)研究中需增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論。

盡管本研究結(jié)果表明hsa_circRNA_103809表達(dá)水平高低與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，但是具體分子機(jī)制尚未闡明。近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA(miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，進(jìn)而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平。Huang等[19]在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_103809可以通過結(jié)合miRNA-101-3p促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Bian等[20]在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_103809可以通過miRNA-532-3p/FOXO4軸調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖和遷移。因此，在接下來的研究中需要明確hsa_circRNA_103809在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制，為hsa_circRNA_103809的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

總之，以上結(jié)果提示hsa_circRNA_103809在原發(fā)性肝癌病人血清中高表達(dá)，且其表達(dá)水平高低與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。隨著研究深入，hsa_circRNA_103809有望成為診斷原發(fā)性肝癌及評估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。