黎華麗，鄭勇斌，程煌榮，楊超

武漢大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科，湖北 武漢 430064

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。據(jù)我國惡性腫瘤統(tǒng)計結(jié)果顯示，CRC發(fā)病率居于第3位，病死率居第5位，且發(fā)病率仍處于上升趨勢[2-3]。而臨床上多數(shù)CRC病人在確診時即處于進展期，CRC的防治工作仍任重道遠。美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)制定的TNM分期是目前應(yīng)用最廣泛的CRC分期系統(tǒng)之一，對預(yù)后評估及后續(xù)治療指導(dǎo)有重要意義，但在臨床實踐中，相同分期病人的預(yù)后也可能存在差異[4]。因此還需要聯(lián)合其他指標一同評估預(yù)后，以制定合適的治療方案。其中，癌胚抗原(CEA)是唯一被推薦用于CRC常規(guī)監(jiān)測的血液學(xué)指標，被認為是針對CRC早期診斷、病情發(fā)展以及預(yù)后的一個較好的腫瘤標志物[5-6]。而癌抗原19-9(CA19-9)存在于胃腸道黏膜、胰腺、膽囊等正常組織細胞表面，在CRC、胃癌等惡性腫瘤中表達水平顯著升高，可作為輔助診斷指標，但缺乏特異性[7]。二者的聯(lián)合檢測被廣泛用于CRC的診斷及預(yù)后評估。CRC術(shù)后病理指標如Ki67表達指數(shù)(lable index,LI)也表現(xiàn)出一定的預(yù)后價值，其作為增殖標志物，廣泛用于腫瘤分級[8]。Ki67已被證實與人CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認為是CRC的一個重要預(yù)測參數(shù)[9]。有研究指出CRC中Ki67高表達與較差的預(yù)后相關(guān)，但據(jù)目前研究，Ki67 LI并不總是與病人預(yù)后相關(guān)[10-11]。目前國內(nèi)少有聯(lián)合術(shù)前血清腫瘤標志物與術(shù)后Ki67分析CRC病人預(yù)后的研究，因此本研究將Ki67的預(yù)后影響與CEA、CA19-9進行單獨或聯(lián)合比較，進行回顧性研究，以分析血清CEA、CA19-9表達和腫瘤細胞Ki67 LI的聯(lián)合檢測對CRC病人預(yù)后評估的價值。

資料與方法

一、一般資料

選取2012年1月至2014年6月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科就診的311例CRC病人為研究對象，進行回顧性分析。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準。病例按照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)制定的TNM分期標準進行臨床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期149例，Ⅲ～Ⅳ期162例。

二、納入及排除標準

納入標準：(1)經(jīng)組織病理確診為腺癌的CRC病人；(2)至少經(jīng)手術(shù)切除原發(fā)病灶；(3)具有完整的病歷資料；(4)術(shù)前未經(jīng)放化療及其他方式治療。排除標準：(1)術(shù)前合并急慢性感染者；(2)合并腸穿孔或腸梗阻；(3)其他原發(fā)惡性腫瘤。

三、方法

收集病人病案資料，包括年齡、性別、聯(lián)系方式、腫瘤分化程度、腫瘤部位、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤最大直徑、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓、外周血CEA、CA19-9及Ki67 LI等信息。以電話和門診隨訪為基礎(chǔ)，術(shù)后第1年隨訪間隔為每3個月1次，之后每隔6個月隨訪1次。術(shù)后隨訪截止時間為2019年6月1日。

四、觀察指標檢測及相關(guān)定義

采集病人入院空腹靜脈血3～5 mL，CEA采用直接化學(xué)發(fā)光法進行檢測，由檢驗科完成，正常值范圍為0～5 μg/L；CA19-9采用ARCHITECT CA19-9XR試劑進行檢測，由檢驗科完成，正常值范圍為0～35 kU/L。采用免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤細胞Ki67表達，即用型鼠抗人單克隆抗體Ki67購自羅氏公司。結(jié)果判斷：Ki67定位于細胞核，呈棕黃色顆粒為陽性細胞；按陽性細胞比例分為：≤10%(-),11%～25%(+),26%～50%(++),≥50%(+++)。如圖1。CEA>5 μg/L定義為陽性，CA19-9>35 kU/L定義為陽性。Ki67 LI大于其對應(yīng)截斷值定義為高表達(陽性)。腫瘤標志物與Ki67并聯(lián)檢測時，全陽性定義為陽性，其余定義為陰性。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS(25.0版)軟件統(tǒng)計分析。繪制受試者工作特征(ROC)曲線尋找Ki67 LI的截斷值[曲線下面積(AUC)最大時]；組間單因素分析采用Log-Rank法檢驗；Cox回歸分析尋找影響CRC病人預(yù)后的獨立危險因素，得出獨立危險因素的風(fēng)險比(HR)。所有分析均采用雙側(cè)檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 結(jié)直腸癌病理組織免疫組化Ki67表達(蘇木素染色，×200) A.Ki67 LI 95%; B.Ki67 LI 10%

結(jié) 果

一、一般情況

按照入組標準，共收集311例病人臨床病理資料，其中男性174例，女性137例，中位年齡63歲(26～89歲)。中位隨訪時間為70個月(3～89個月)，其中失訪18例，隨訪率94.2%(293/311)，隨訪期間病人發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移或拒絕信息采集6例；死亡101例，病死率32.5%(101/311)。詳見表1。Ki67 LI的截斷值、靈敏度、特異度、AUC分別為0.34、0.528、0.816、0.727，見圖2。

二、單因素生存分析結(jié)果

生存分析結(jié)果顯示，CEA陽性、CA19-9陽性和Ki67高表達與CRC病人總生存人數(shù)及5年生存率相關(guān)(均P<0.01)。此外還與病理類型為低分化、有脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期有關(guān)(均P<0.01)。詳見表1、表2。聯(lián)合血清腫瘤標志物和Ki67 LI時，Log-Rank檢驗結(jié)果顯示，均陰性時病人預(yù)后最好，單陽性時次之，均陽性時最差，5年生存率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。詳見表2。

三、Cox回歸分析

Cox回歸多因素分析顯示，CRC TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、CEA陽性、CA19-9陽性、CEA+Ki67陽性及CA19-9+Ki67陽性是CRC病人預(yù)后的獨立危險因素(均P<0.05)。當校正其他影響因素后，CEA陽性的CRC病人的死亡風(fēng)險是CEA陰性病人的6.461倍[95%CI(3.693，11.304)，P<0.01]；CA19-9為2.046倍[95%CI(1.214,3.449)，P=0.007]；TNM分期Ⅲ～Ⅳ的病人死亡風(fēng)險是TNM分期Ⅰ～Ⅱ病人的2.104倍[95%CI(1.597,5.242)，P=0.028]；CEA+Ki67陽性病人的死亡風(fēng)險為CEA+Ki67陰性病人的9.992倍[95%CI(5.337,18.706)，P<0.01]；CA19-9+Ki67為5.345倍[95%CI(2.282,12.521)，P<0.01]。CEA+CA19-9、CEA+CA19-9+Ki67聯(lián)合檢測并未進入回歸模型。詳見表3。

表1 311例結(jié)直腸癌病人預(yù)后單因素分析

圖2 Ki67 LI受試者工作特征(ROC)曲線

表2 311例結(jié)直腸癌病人并聯(lián)檢測指標結(jié)果與預(yù)后單因素分析

表3 本組結(jié)直腸癌病人預(yù)后的Cox回歸多因素分析結(jié)果

討 論

腫瘤分子標志物是惡性腫瘤在生長及增殖過程中產(chǎn)生的一類特異性物質(zhì)，如術(shù)前CEA、CA19-9是目前臨床上CRC病人最常檢測的指標。Ki67 LI也是術(shù)后腫瘤組織病理免疫組化中的檢測項目之一。本文首次將腫瘤標志物與術(shù)后病理指標聯(lián)合起來檢測，探討了CEA+Ki67、CA19-9+Ki67及CEA+CA19-9+Ki67在評估CRC病人預(yù)后方面的價值。Log-Rank檢驗結(jié)果提示，聯(lián)合腫瘤標志物和Ki67 LI均陰性時病人預(yù)后最好，單陽性時次之，均陽性時最差；進一步行多因素Cox回歸分析顯示，CEA+Ki67陽性、CA19-9+Ki67陽性、CEA陽性、CA19-9陽性以及TNM分期Ⅲ～Ⅳ均為CRC病人預(yù)后的獨立危險因素。當校正其他影響因素后，CEA陽性CRC病人的死亡風(fēng)險是CEA陰性病人的6.461倍[95%CI(3.693,11.304)，P<0.01)；CA19-9為2.046倍[95%CI(1.214,3.449)，P=0.007]；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人死亡風(fēng)險是TNM分期Ⅰ～Ⅱ期病人的2.104倍[95%CI(1.597,5.242)，P=0.028]；CEA+Ki67陽性病人的死亡風(fēng)險為CEA+Ki67陰性病人的9.992倍[95%CI(5.337,18.706)，P<0.01]；CA19-9+Ki67為5.345倍[95%CI(2.282,12.521)，P<0.01]。CEA+CA19-9、CEA+CA19-9+Ki67聯(lián)合檢測未進入回歸模型。這提示，聯(lián)合聯(lián)測腫瘤標志物和Ki67 LI對CRC病人的預(yù)后評估具有重要意義，對Ki67高表達、CEA或CA19-9陽性病人，即使臨床分期較早，也應(yīng)密切隨訪或采取更積極的治療。

CEA和CA19-9是目前CRC中最常見的腫瘤標志物檢測組合，兩者聯(lián)合檢測對CRC的診斷、治療和監(jiān)測具有確切指導(dǎo)意義。CEA在多種腺癌細胞中有表達，尤其在CRC細胞中較常出現(xiàn)高表達，且血清CEA水平升高常與預(yù)后不良相關(guān)[12]；CA19-9是目前胰腺腫瘤常用監(jiān)測標志物，其與CRC間關(guān)系也較為密切。有研究顯示，CA19-9對轉(zhuǎn)移性CRC也可提供有價值的預(yù)后信息，血清CA19-9水平升高與不良預(yù)后相關(guān)[12]。王宏等[13]報道，與良性病變組和對照組相比，血清CEA和CA19-9表達水平在CRC病人中顯著升高，且CEA和CA19-9區(qū)分CRC與良性病變組、對照組的敏感性/特異性分別為63.1%/79.4%、66.2%/61.7%。作為較為簡便、經(jīng)濟的檢測指標，CEA和CA19-9已廣泛用于CRC病人的診斷和隨訪，但其作為CRC診斷和預(yù)后的傳統(tǒng)指標，尚存在敏感性不足、特異性較低等問題。本研究中，CEA+CA19-9聯(lián)合檢測時發(fā)現(xiàn)均陰性時預(yù)后最好，5年生存率為88.5%，單陽性時次之，雙陽性時最差，5年生存率為10%。但多因素分析結(jié)果顯示CEA+CA19-9陽性[HR=1.149,95%CI(0.750,1.759)，P=0.523]、CEA+CA19-9+Ki67陽性[HR=1.010,95%CI(0.678,1.505)，P=0.961]并非CRC不良預(yù)后的獨立危險因素，而CEA+Ki67、CA19-9+Ki67聯(lián)合陽性為獨立預(yù)后因素。提示聯(lián)合腫瘤標志物和Ki67 LI可能為CRC病人預(yù)后評估帶來更好的效果。

Ki67蛋白是一種與細胞增殖特異相關(guān)的細胞核抗原，在增殖細胞的所有細胞周期活動期表達，在靜止細胞中不表達，但Ki67蛋白的量隨細胞周期的不同而發(fā)生改變[14]。大量研究證實，Ki67蛋白的高表達與腫瘤的生物學(xué)特性及腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，Ki67因而成為檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標之一，目前已成為臨床病理診斷常規(guī)檢測項目，用于指導(dǎo)術(shù)后治療方案的選擇及預(yù)后評估[15]。據(jù)報道，在CRC中，Ki67高表達與分期晚、預(yù)后差相關(guān)，高表達組病人無病生存率顯著低于低表達組病人。但也有回顧性研究顯示Ki67表達高低與CRC病人臨床結(jié)局間無直接聯(lián)系，Ki67 LI并不總與CRC病人臨床結(jié)局相關(guān)[11,16]。本研究中，Ki67表達與CRC病人術(shù)后總生存率和5年生存率相關(guān)。將Ki67分別與CEA、CA19-9兩兩聯(lián)合或聯(lián)合檢測時發(fā)現(xiàn)，均陰性時預(yù)后最好，5年生存率分別為94.1%、94.1%、88.2%，單陽性時次之，雙陽性時最差，5年生存率分別為14.3%、18.7%、8.5%。多因素分析結(jié)果顯示Ki67+CEA、Ki67+CA19-9均為CRC病人的獨立預(yù)后因素，而CEA+CA19-9、CEA+CA19-9+Ki67并非CRC病人不良預(yù)后的獨立危險因素。提示并非簡單聯(lián)合腫瘤標志物和Ki67 LI即可增加預(yù)后判斷的有效性，而是Ki67+CEA、Ki67+CA19-9聯(lián)合檢測可為CRC病人預(yù)后評估提供指導(dǎo)意義。此外，也有研究顯示表皮生長因子受體(EGFR)的表達與CRC腫瘤轉(zhuǎn)移和較短的病人生存時間相關(guān)，其他諸如K-ras和BRAF等免疫指標也可指導(dǎo)CRC病人預(yù)后[17-19]，聯(lián)合這類免疫指標和腫瘤標志物或許也可得出類似結(jié)論，甚至更好地指導(dǎo)病人預(yù)后。需注意的是，本研究結(jié)果可能是本研究樣本量較小引起的，此結(jié)論尚需更大樣本量的臨床試驗驗證。

本研究的結(jié)果提示，術(shù)前腫瘤標志物與術(shù)后病理指標Ki67的聯(lián)合可能為CRC病人預(yù)后評估提供指導(dǎo)意義。但是，由于本研究是單中心的回顧性研究，選擇偏倚可能較大，且目前國際上對于Ki67蛋白表達指數(shù)高低尚無明確的判定標準，該結(jié)論尚需更高質(zhì)量的大樣本臨床研究驗證。