許丁帆，劉艷軍，焦思鵬，黃俊軒，武春霞，李建科

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384)

絲綿木(EuonymusmaackiiRupr.)屬衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(Euonymus)植物，落葉灌木或小喬木，適應(yīng)性強(qiáng)分布范圍廣，耐貧瘠、耐鹽堿、抗惡劣環(huán)境，空氣凈化能力強(qiáng)，具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。絲棉木木材特性佳、實(shí)用性強(qiáng)，是中國西北地區(qū)園林綠化的主要樹種，秋季橙紅色的葉片和粉紅色的蒴果均有很高的觀賞價(jià)值，極具發(fā)展?jié)摿3]。目前，絲棉木種苗主要以播種、扦插和嫁接等常規(guī)手段進(jìn)行繁殖[4-6]。雖然操作簡便，技術(shù)難度低，但播種繁殖不能較好地保存親本的優(yōu)良性狀，且周期長；扦插繁殖植株根系較實(shí)生苗淺、弱；嫁接方式繁殖易受季節(jié)限制。此外，扦插與嫁接時(shí)，傷口易受微生物侵染，致使苗木微生物病菌逐漸積累，導(dǎo)致苗木生長緩慢甚至死亡。利用植物組織培養(yǎng)進(jìn)行絲棉木快速繁殖[7-9]，雖然一定程度緩解了種苗的數(shù)量問題，但由于絲棉木組培苗長期繼代培養(yǎng)，內(nèi)生菌會(huì)隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)增加而逐代積累，導(dǎo)致組培苗質(zhì)量下降，組培苗污染等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，阻礙絲棉木優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)。

關(guān)于絲棉木組培脫菌的研究未見報(bào)道，利用植物組培脫菌技術(shù)，并結(jié)合組培快繁技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)脫菌組培苗，以增強(qiáng)組培苗的抗逆性，滿足生產(chǎn)上對絲棉木優(yōu)質(zhì)種苗的需求，同時(shí)也可以大量減少農(nóng)藥的使用，對環(huán)境保護(hù)具有重要意義。因此，本試驗(yàn)采用絲棉木莖段為外植體，利用制霉菌素、硫酸鏈霉素和羧芐青霉素鈉3種抗生素進(jìn)行絲棉木脫菌處理，尋找絲棉木外植體組培脫菌的最佳途徑，獲得絲棉木脫菌組培苗，建立絲棉木組培脫菌體系，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)絲棉木種苗提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用絲棉木1 a生休眠枝條取自天津農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓西南側(cè)成齡的絲棉木植株；制霉菌素(nystatin；USP,≥4 400 units/mg)和羧芐青霉素鈉(carbenicillin disodium salt；USP)購于上海麥克林生化科技有限公司；硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate；>95%)購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 絲棉木組培苗的獲得

將取回的絲棉木枝條置于自來水下沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)中，將枝條剪成2～3 cm的小段，每段帶1～2個(gè)腋芽。用70%乙醇處理30 s，然后置于30%(V/V)次氯酸鈉溶液中處理10 min，無菌水沖洗3次，每次沖洗5 min，并用無菌濾紙吸干外植體表面水分，接種到1/2 MS+5.0 mg/L GA3固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 Lx，24 h光照。期間不定時(shí)出現(xiàn)細(xì)菌或真菌污染，每天觀察并剔除被污染的外植體。培養(yǎng)30 d后將生長正常的腋芽切下，轉(zhuǎn)接至1/2 MS+0.25 mg/LNAA培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得大量組培苗備用。

1.2.2 絲棉木脫菌處理

取株高、長勢一致的組培苗，剪取長度約1.0 cm的莖尖，分別接種到含有不同濃度與種類抗生素的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基分別單獨(dú)添加不同濃度的制霉菌素(25、50、75、100 mg/L)、硫酸鏈霉素(25、50、75、100 mg/L)、羧芐青霉素鈉(125、250、500、750 mg/L)；不同抗生素組合(50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素、50 mg/L制霉菌素+250 mg/L羧芐青霉素鈉、50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉、50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉)。所有培養(yǎng)基均添加20 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，高壓滅菌前調(diào)節(jié)pH=5.8，分裝在500 mL廣口三角瓶中，培養(yǎng)基于121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min，滅菌后冷卻備用。將凝固備用的培養(yǎng)基用微波爐加熱融化，待其溫度降至60～70 ℃時(shí)在超凈臺(tái)中加入所需抗生素?？股刂兄泼咕貫榉撬苄?，以二甲基亞砜為溶劑，配成50 mg/L的母液；硫酸鏈霉素與羧芐青霉素鈉為水溶性，以蒸餾水為溶劑，分別配成50、250 mg/L母液。為防止抗生素高溫分解，抗生素溶解后采用 0.22 μm的無菌微孔過濾器進(jìn)行抽濾滅菌，滅菌后加入未凝固的培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)5次。培養(yǎng)條件同1.2.1，每天觀察不同處理對絲棉木莖尖外植體的生長情況，30 d后統(tǒng)計(jì)絲棉木莖尖的存活率、真菌污染率、細(xì)菌污染率和平均生長量。

1.2.3 絲棉木組培苗的增殖培養(yǎng)及脫菌效果檢測

將長約1.0 cm的絲棉木莖尖在1/2 MS+50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，每20 d繼代培養(yǎng)一次，每次繼代培養(yǎng)時(shí)剪取外植體上端約1.0 cm的莖尖，分別繼代培養(yǎng)1、2、3、4次。選取脫菌處理后成活且長勢良好的絲棉木外植體，將其轉(zhuǎn)移到1/2 MS+1.0 mg/LBA+0.5 mg/LNAA的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以長勢一致的未經(jīng)脫菌處理組培苗為對照，20 d后統(tǒng)計(jì)外植體的增殖系數(shù)、真菌污染率、細(xì)菌污染率及增殖芽生長勢情況。處理重復(fù)3次，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，培養(yǎng)條件同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

成活率=(成活外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

真菌污染率=(真菌污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

細(xì)菌污染率=(細(xì)菌污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

平均生長量=∑(脫菌處理30 d后莖尖外植體高-處理前莖尖外植體高)/存活外植體數(shù)；

增殖系數(shù)=(增殖后總芽數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2013和SPSS Statistic 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 制霉菌素對絲棉木莖尖外植體抑菌效果的影響

由表1可知，在未添加制霉菌素的培養(yǎng)基中，絲棉木莖尖外植體出現(xiàn)不同程度的真菌與細(xì)菌污染；但隨著培養(yǎng)基中制霉菌素濃度的增大，絲棉木莖尖外植體真菌污染率顯著降低，細(xì)菌污染率無顯著變化，說明制霉菌素能夠有效抑制絲棉木外植體真菌污染，但對細(xì)菌污染無明顯作用。絲棉木莖尖外植體成活率、平均生長量隨制霉菌素濃度的增加而降低；當(dāng)培養(yǎng)基中制霉菌素濃度≥50 mg/L時(shí)，絲棉木外植體成活率與平均生長量均顯著降低且外植體基部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，葉片黃化，說明制霉菌素對絲棉木具有一定的毒害作用，濃度越高，毒害作用越明顯。當(dāng)培養(yǎng)基中制霉菌素濃度為50 mg/L時(shí)，絲棉木莖尖外植體真菌污染率較CK顯著降低，真菌污染率由CK的14.00%降至1.33%，此時(shí)對絲棉木莖尖外植體成活率無顯著影響，莖尖可以生長正常。因此，在培養(yǎng)基中添加50 mg/L制霉菌素可有效抑制絲棉木莖尖外植體真菌污染。

表1 不同濃度制霉菌素對絲棉木莖尖外植體的影響

2.2 硫酸鏈霉素對絲棉木莖尖外植體抑菌效果的影響

從表2可以看出，與對照相比，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的硫酸鏈霉素，絲棉木莖尖外植體真菌污染率無顯著變化，說明硫酸鏈霉素對抑制絲棉木莖尖外植體真菌污染無明顯作用。隨著培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素濃度的增大，絲棉木外植體細(xì)菌染菌率隨之降低，但當(dāng)培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素濃度≥50 mg/L，細(xì)菌污染率不再顯著下降，增加硫酸鏈霉素濃度后絲棉木莖尖不能正常生長，新葉白化，基部出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象。同時(shí)，從莖尖外植體的平均生長量看，平均生長量隨著培養(yǎng)基中硫酸鏈霉素濃度的升高而降低，說明硫酸鏈霉素在一定程度上抑制絲棉木莖尖生長，采用增加硫酸鏈霉素濃度來提高其抑制細(xì)菌的效果的方法不可行。因此，單獨(dú)使用硫酸鏈霉素雖能在一定程度上降低莖尖外植體的細(xì)菌污染率，但不能完全抑制莖尖外植體的細(xì)菌污染。

表2 不同濃度硫酸鏈霉素對絲棉木莖尖外植體的影響

2.3 羧芐青霉素鈉對絲棉木莖尖外植體抑菌效果的影響

由表3可知，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的羧芐青霉素鈉對絲棉木莖尖存活率無顯著影響，在含不同濃度羧芐青霉素鈉的培養(yǎng)基上絲棉木莖尖均能夠正常生長，但絲棉木莖尖生長量受到影響，絲棉木的平均生長量隨著培養(yǎng)基中羧芐青霉素鈉濃度的升高而顯著降低。與CK相比，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的羧芐青霉素鈉絲棉木莖尖的真菌污染率并沒有顯著降低，說明羧芐青霉素鈉對真菌污染沒有抑制作用；在一定濃度范圍內(nèi)，絲棉木莖尖的細(xì)菌污染率隨羧芐青霉素鈉濃度的升高而降低，但當(dāng)培養(yǎng)基中羧芐青霉素鈉濃度≥250 mg/L，細(xì)菌污染率無顯著變化，此時(shí)培養(yǎng)基中均為同種白色細(xì)菌污染，分析原因可能是羧芐青霉素鈉對該種細(xì)菌無明顯抑制作用。

表3 不同濃度羧芐青霉素鈉對絲棉木莖尖外植體的影響

2.4 抗生素組合處理對絲棉木莖尖外植體抑菌效果的影響

由于單獨(dú)使用一種抗生素抑菌效果不佳，試驗(yàn)在3種不同抗生素最適濃度的基礎(chǔ)上，以3種抗生素的不同組合對絲棉木莖尖外植體進(jìn)行抑菌處理。由表4知，絲棉木莖尖在所有含不同抗生素組合處理的培養(yǎng)基中，均能正常生長，但平均生長量較3個(gè)對照明顯減小。從內(nèi)生菌污染情況看，當(dāng)培養(yǎng)基中加入50 mg/L制霉菌素與50 mg/L硫酸鏈霉素或250 mg/L羧芐青霉素鈉時(shí)，均能有效抑制絲棉木真菌污染，而細(xì)菌污染率與對照相比，未發(fā)生明顯變化；當(dāng)培養(yǎng)基中50 mg/L硫酸鏈霉素與250 mg/L羧芐青霉素鈉配合使用時(shí)，對抑制絲棉木細(xì)菌污染效果顯著，但對真菌污染無顯著抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中加入制霉菌素、硫酸鏈霉素和羧芐青霉素鈉3種抗生素時(shí)，雖然絲棉木莖尖外植體成活率低于其他處理，但能夠有效地抑制絲棉木組培苗真菌與細(xì)菌污染。因此，在1/2 MS+50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉培養(yǎng)基上進(jìn)行絲棉木組培苗脫菌處理效果較佳。

表4 不同抗生素組合處理對絲棉莖尖外植體的影響

2.5 繼代培養(yǎng)次數(shù)對絲棉木脫菌效果的影響

將在1/2 MS+50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)不同次數(shù)的絲棉木莖尖，分別接種到不含抗生素的絲棉木增殖培養(yǎng)基上，20 d后絲棉木增殖培養(yǎng)結(jié)果差異顯著。增殖培養(yǎng)結(jié)果顯示(表5)，隨著脫菌處理繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，絲棉木真菌與細(xì)菌污染率逐漸降低，增殖系數(shù)不斷提高，增殖芽生長勢逐漸增強(qiáng)，說明絲棉木脫菌效果隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而不斷增強(qiáng)，同時(shí)與增殖系數(shù)呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，在短時(shí)間內(nèi)絲棉木外植體很難脫除內(nèi)生菌的影響，內(nèi)生菌需要隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加逐漸脫除。在含50 mg/L制霉菌素、50 mg/L硫酸鏈霉素和250 mg/L羧芐青霉素鈉的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3～4次以后，絲棉木增殖系數(shù)顯著提高，增殖芽生長勢強(qiáng)，均明顯優(yōu)于其它處理，且增殖培養(yǎng)時(shí)基本無內(nèi)生真菌與細(xì)菌污染出現(xiàn)，處理4的細(xì)菌污染為人工接種導(dǎo)致的外源污染。

表5 不同繼代培養(yǎng)次數(shù)對絲棉木增殖培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，污染主要可分為內(nèi)源污染和外源污染兩大類。初次接種的外植體在2～3 d內(nèi)就能在外植體周圍或培養(yǎng)基表面長菌，屬于外源污染，主要由外植體表面攜帶或操作不當(dāng)?shù)仍蛟斐?；?nèi)源污染主要指由外植體本身所攜帶的內(nèi)生菌造成的污染，內(nèi)生菌一般較難采用表面消毒方法清除，一般在接種一段時(shí)間后才出現(xiàn)菌落[10]。外源污染只要選擇適合的外植體消毒方法、操作嚴(yán)格要求，環(huán)境條件嚴(yán)格控制，一般可控制在理想范圍內(nèi)；而內(nèi)源性污染，因其具有隱蔽性，是最難控制的污染源[11-12]。隨著對抗生素作用機(jī)理的不斷深入研究, 抗生素越來越廣泛的應(yīng)用于組培脫菌研究中, 而且控制抗生素使用濃度在一定范圍內(nèi)不對外植體造成傷害[13]。同時(shí)，生產(chǎn)上可以選用獸用抗生素來降低生產(chǎn)成本，且獲取容易[14]。

本試驗(yàn)中50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉混合使用的抑菌效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用一種抗生素，能夠有效抑制絲棉木組培苗細(xì)菌污染。這與簡興[15]在抑制紅掌(Anthuriumandraeanum)細(xì)菌污染中發(fā)現(xiàn)使用300 mg/L的青霉素+180 mg/L鏈霉素，效果好于1 000 mg/L鏈霉素單獨(dú)使用的結(jié)果基本一致。究其原因，是因?yàn)榍嗝顾嘏c鏈霉素合用具有一定的增強(qiáng)與協(xié)同作用，對多數(shù)細(xì)菌起到抑制作用。因此，在使用不同抗生素種類時(shí)，還需考慮抗生素之間的協(xié)同或拮抗作用。黃俊軒等[16]在利用抗生素進(jìn)行北美海棠(North American Crabapple)組培苗脫菌培養(yǎng)時(shí)，僅用抗生素的標(biāo)準(zhǔn)抗菌濃度進(jìn)行試驗(yàn)，未采用不同抗生素濃度處理，不能準(zhǔn)確獲得不同抗生素對北美海棠的最佳抑菌濃度。本試驗(yàn)具體研究了3種抗生素不同濃度對絲棉木組培苗抑菌效果及生長的影響，可準(zhǔn)確獲得制霉菌素、硫酸鏈霉素與羧芐青霉素鈉對絲棉木的最佳使用濃度，分別為50、50、250 mg/L。并在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高濃度的制霉菌素與硫酸鏈霉素均對絲棉木組培苗產(chǎn)生不利影響，這與田永亮等[17]抗生素在較高的濃度下會(huì)對植物的生長產(chǎn)生不利的影響,過高濃度的抗生素同樣會(huì)殺死植物的結(jié)論一致。但本試驗(yàn)中較高濃度的羧芐青霉素鈉未對絲棉木組培苗生長產(chǎn)生明顯抑制作用, 這可能與植物的種類不同有關(guān),不同植物對不同抗生素種類的忍耐程度不同。

絲棉木脫菌具體步驟總結(jié)如下：以絲棉木帶1～2個(gè)腋芽的莖段為外植體，經(jīng)外植體消毒后，獲得表面無污染的組培苗；剪取組培苗上端長約1.0 cm莖尖，接種至1/2 MS+50 mg/L制霉菌素+50 mg/L硫酸鏈霉素+250 mg/L羧芐青霉素鈉培養(yǎng)基上，每隔20 d繼代培養(yǎng)一次，3～4次繼代培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)移至1/2 MS+0.25 mg/L NAA上進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)，即可獲得優(yōu)質(zhì)的絲棉木脫菌組培苗。本結(jié)果可直接應(yīng)用于絲棉木組培快繁研究中，為絲棉木優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。