（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)和草原局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；3.經(jīng)濟林種質(zhì)創(chuàng)新利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，湖南 鄭州 450003）

杜仲Eucommia ulmoides為杜仲科杜仲屬Eucommia植物，又是我國特有的第三紀孑遺植物，具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)價值[1]。杜仲為嚴格雌雄異株，雌雄株的分布比例近似1∶1[2]。杜仲雌花單生于苞片腋間，授粉后發(fā)育成果實，其種仁軋制的杜仲籽油含有多種代謝產(chǎn)物以及豐富的不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸含量達60%左右，可制作成杜仲亞麻酸軟膠囊等產(chǎn)品[3]；果皮是提取杜仲膠的重要原材料，在醫(yī)療工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。杜仲雄花簇生于苞片腋間，其花粉活性成分和營養(yǎng)成分的含量和種類十分豐富，是一種珍貴的藥用花粉資源，由雄花開發(fā)出了杜仲雄花茶、雄花酒等產(chǎn)品[4]。

花芽分化是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要標志之一，分化過程受植物和外界因素共同影響，分化時間、數(shù)量和質(zhì)量與經(jīng)濟林木的早實性、豐產(chǎn)性、穩(wěn)定性以及商品價值緊密相關(guān)。花芽分化是一個復(fù)雜的生理生化、基因調(diào)控和形態(tài)發(fā)生變化的過程，對植物花芽分化的研究包括花芽生長錐分生組織細胞的形態(tài)學(xué)觀察，碳氮化合物和激素等生理生化指標變化以及開花調(diào)控相關(guān)基因的變化[5]。劉朝暉等對杜仲雌雄花芽分化進程的解剖結(jié)構(gòu)進行了觀察，但未對花芽外部形態(tài)和內(nèi)源激素動態(tài)變化進行觀察和測定[6]。不同地區(qū)的氣候條件、立地條件或栽培品種存在差異，植物花芽分化時間和進程也會發(fā)生變化，因此僅根據(jù)前人研究不能準確判斷其它地區(qū)的花芽具體分化進程，進而影響研究區(qū)域栽培管理和進一步試驗研究[7]?；ㄑ客獠啃螒B(tài)特征與內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性，在花芽發(fā)育過程中建立形態(tài)標記利于判斷不同環(huán)境條件下花芽的分化進程，根據(jù)早實核桃Juglans regia雌花芽的大小、性狀、鱗片質(zhì)地和顏色判斷花芽內(nèi)部結(jié)構(gòu)[8]。植物內(nèi)源激素含量和動態(tài)變化與植物過程密切相關(guān)，如低ABA/IAA 促進油菜的成花誘導(dǎo)和花器官發(fā)育，但高ABA/IAA 則有利于花芽形態(tài)分化[9]；銀杏Ginkogo biloba花芽不同發(fā)育階段，雌雄花芽中ABA、IAA 和ZRs 含量發(fā)生變化，且在雌雄花芽中變化趨勢存在差異[10-11]。研究顯示通過噴施外源激素能夠影響杜仲短周期林地上部分生物量和杜仲膠產(chǎn)量[12]。杜仲也是雌雄異株孑遺植物，因此通過觀察杜仲雌、雄花芽分化過程中內(nèi)外形態(tài)結(jié)構(gòu)，以期建立花芽發(fā)育形態(tài)標記；同時分析不同發(fā)育時期雌雄花芽中ABA、IAA 和ZRs含量動態(tài)變化，了解這3 種內(nèi)源激素對杜仲雌、雄花芽分化的作用，為進一步杜仲花芽發(fā)育研究提供依據(jù)以及為科學(xué)指導(dǎo)杜仲栽培管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究中心原陽試驗基地（34°55′18″～34°56′27″N，113°46′14″～113°47′35″E）。材料為杜仲良種示范園栽培的7年生嫁接苗果用國審杜仲良種‘華仲6 號’（F6）和雄花用國審杜仲良種‘華仲11 號’（M11）為研究材料。分別選取3 棵生長勢均勻且無病蟲害的雌、雄株作為樣株。從2017年4月25日—9月30日每隔4 d 采樣一次，10—12月每隔9 d 采樣一次，材料采集混合后，投放入FAA 固定液（70%乙醇∶冰乙酸∶38%甲醛=18∶1∶1）保存固定，后帶回實驗室-4℃低溫保存。同時，在采集FAA 固定材料時，每樣株另采集花芽30粒立即投放入液氮中，帶回實驗室保存在-80℃超低溫冰箱，用于植物激素測定，雌、雄株各3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 外部和內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察

每取樣周期分別選取10 個典型雌雄株花芽進行外部形態(tài)觀測，測定指標包括花芽大小、苞片數(shù)量、苞片顏色以及質(zhì)地的變化，同時數(shù)碼相機拍照記錄外部形態(tài)。內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察按照常規(guī)石蠟切片方法進行制片[12]，F(xiàn)AA 固定的材料逐漸酒精脫水、二甲苯透明、變溫浸蠟、切片，粘片后用番紅固綠雙重染色、脫蠟、復(fù)水、番紅-固率復(fù)染、中性樹膠封片后OLYMPUS 光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.3 內(nèi)源激素測定

在花芽形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上，選取不同發(fā)育階段的花芽，用液氮研磨植物材料至粉末狀后，稱取0.1～0.2 g 樣品于10 mL 離心管中，然后進行提取、提取液在過柱、洗脫、吹干、復(fù)溶、離心后上機。利用高效液相色譜-電離串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-ESIMS/MS）測定激素含量[13]。通過AB Analyst 化學(xué)工作站進行數(shù)據(jù)的采集和獲取。將混合標準品溶液逐級稀釋成系列標準品溶液，以標準品濃度x(ng/mL)為橫坐標，以對照品峰面積值y為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣品中目標物含量。利用T 檢驗分析相同發(fā)育時期的雌、雄花芽內(nèi)源激素含量差異顯著性，在Excel 2016 軟件中繪制折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲雌、雄花芽分化形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)杜仲雌、雄花芽外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果，花芽分化過程可分為5 個時期：花序原基分化期（4月下旬至5月下旬）、苞片原基分化期（6月上旬至6月中上旬）、雌/雄蕊原基分化期（6月中下旬至6月下旬）、雌/雄蕊形態(tài)建成期（7月上旬至11月上旬），隨后在低溫影響下雌雄花芽停止生長進入休眠期（11月中下旬至次年2月中上旬），其中雌雄花芽在雌/雄蕊原基分化期生長速度較快、花芽高度和寬度發(fā)生明顯變化，同時雌雄花芽高度在雌/雄蕊形態(tài)建成期差異達到顯著（表1）。在花序原基分化期，花芽由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)為生殖生長，雌、雄花芽形態(tài)特征比較相似，芽體幼嫩青綠色，芽頂端尖細、基部寬大、近似為三角形，表面分布著白色柔毛（圖1A1、C1）；內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)顯示花芽頂端隆起，呈錐形，細胞質(zhì)濃厚，分生能力強烈（圖1B1、D1）。苞片原基分化期，花芽苞片層數(shù)增加，且最外層苞片頂端逐漸木質(zhì)化，頂部顏色變?yōu)楹稚?，但仍分布少量柔毛（圖1A2、C2）；內(nèi)部結(jié)構(gòu)顯示花芽基部至頂部分化出較多的苞片原基，且芽頂端分生組織加寬、變平（圖1B2、D2）。雌/雄蕊原基分化期，外側(cè)3～4層苞片逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轺[片狀，花芽呈褐色，內(nèi)部可觀察到雌花芽苞片原基腋間形成圓形小凸起即雌蕊原基，雄花芽苞片原基腋間形成數(shù)枚雄蕊原基簇生在苞片腋間，此時可根據(jù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)區(qū)分雌雄花芽（圖1B3、D3）。雌/雄蕊形態(tài)建成期，花芽鱗片層數(shù)增至5～7 層，閉合緊密，雌花芽頂部比雄花芽頂部偏尖（圖1A4—5、C4—5）；內(nèi)部觀察結(jié)果顯示雌蕊原基逐漸伸長、發(fā)育成近羽狀、頂部二裂形成柱頭（圖1B4—5），而雄蕊原基的花藥壁逐漸發(fā)育完全，分化出表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層（圖1D4—5）。

表1 雌雄花芽分化過程內(nèi)外部形態(tài)特征?Table 1 External morphology and internal structure of female and male floral bud development

2.2 雌雄配子體發(fā)育過程

2.2.1 杜仲雌雄花芽萌動觀察

第二年2月下旬氣溫回升后，杜仲雌、雄花芽休眠解除。其中，當(dāng)高于5.0℃的有效積溫達27.5℃左右時，雄花芽苞片開始變綠，雌花芽開始萌動；有效積溫達35.3℃左右時，雄花芽苞片完全變綠且形成小孢子母細胞，雌花芽進行縱向生長；有效積溫達85.3℃左右時，雄花芽苞片完全張開、露出雄蕊且小孢子母細胞進行減數(shù)分裂形成四分體，雌花芽苞片變綠，不斷伸長且胚珠原基開始發(fā)育、逐漸突起；有效積溫達170.1℃左右時，雄配子體發(fā)育成熟，形成二細胞花粉粒，雄花開始散粉，雌花芽大孢子母細胞進行減數(shù)分裂發(fā)育為功能大孢子母細胞，雌蕊柱頭開始授粉（表2）。

圖1 不同分化期雌雄花芽內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)及其外部形態(tài)特征Fig.1 The external morphology structure and anatomic structure of female and male flower bud in different differentiated phases

表2 雌雄配子體發(fā)育過程內(nèi)外部形態(tài)特征Table 2 External morphology and internal structure of male and female gametophytes development

2.2.2 大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育過程

杜仲雄花花藥具有4 個花粉囊，橫切面為典型的蝴蝶形結(jié)構(gòu)（圖2C）。在7月中旬雄蕊原基的周緣組織和造孢組織開始進行伸長生長和邊緣生長產(chǎn)生花藥原基（圖2A）?；ㄋ幵? 個角隅處細胞具有高度分裂能力，迅速分裂形成核大、質(zhì)濃的孢原細胞，而最外面分化出一層表皮；孢原細胞分裂速度快，經(jīng)一次平周分裂形成初生周緣細胞（外層）和初生造孢細胞；至11月上旬，初生周緣細胞經(jīng)過不斷分裂完成花藥壁發(fā)育，由外自內(nèi)分別形成表皮細胞（1 層）、藥室內(nèi)壁（1 層）、中層細胞（2～3 層）及絨氈層細胞（1 層）（圖2B—C）。次年3月1日左右初生造孢細胞經(jīng)過多次有絲分裂形發(fā)育成小孢子母細胞，3月10日左右小孢子母細胞進行減數(shù)分裂（圖2E），最終形成四分體，為四面體型，一般可觀察到3 個細胞（圖2F）。3月中下旬花粉粒逐漸發(fā)育成熟，發(fā)育成2-核花粉粒（圖2G），中層細胞和絨氈層細胞逐漸發(fā)生解離直至完全被吸收，花藥壁僅剩下表皮和藥室內(nèi)壁，花粉粒散出（圖2H）。

杜仲的大孢子發(fā)生晚于小孢子發(fā)生10 d左右，當(dāng)小孢子母細胞開始減數(shù)分裂時，胚珠原基開始突起發(fā)育。杜仲雌蕊具2 心皮，子房1 室，有花柄，扁平，頂端2 裂成柱頭，柱頭反曲生于子房裂口內(nèi)側(cè)，無花柱；柱頭由不規(guī)則的薄壁細胞組成，兩柱頭在子房壁中延伸一段距離后愈合（圖2I）。其中胚珠原基具有強烈的分裂能力，前端發(fā)育成珠心，基部發(fā)育成珠柄（圖2J）。隨著胚珠原基的發(fā)育，珠心表皮下分化出核大、質(zhì)濃的孢原細胞（圖2K—L）。孢原細胞進行平周分裂產(chǎn)生周緣細胞和造孢細胞，后者直接發(fā)育成大孢子母細胞，此時大孢子母細胞體積大、核大、細胞質(zhì)較濃，位于珠心表皮和周緣細胞下，因此胚珠發(fā)育屬于厚珠心型（圖2M）。隨后大孢子母細胞進入減數(shù)分裂，經(jīng)第一次減數(shù)分裂形成二分體（圖2N），然后經(jīng)第二次減數(shù)分裂后大孢子四分體呈線型排列（圖2O）。其中四分體中位于珠孔端的3 個大孢子逐漸退化，僅合點端的1 個發(fā)育為功能大孢子（圖2P）。

圖2 大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育Fig.2 Megasporogenesis,microsporogenesis and development of female and male gametophytes

2.3 雌雄花芽不同發(fā)育時期內(nèi)源激素含量變化

杜仲雌、雄花芽的ABA、IAA 和ZR 含量在不同發(fā)育時期均發(fā)生了變化，其中ABA 含量在雌雄花芽間變化趨勢不一致，但IAA 和ZR 含量在雌雄花芽間變化趨勢一致（圖3）。雌花芽ABA含量呈“降低—升高—降低”的趨勢，而雄花芽呈“升高—降低—升高—降低”的趨勢，除了在雌雄蕊原基分化期（6月14日），雌花芽ABA 含量在其它發(fā)育時期均顯著高于雄花芽（圖2～3）。雌、雄花芽的ABA 含量均在花芽休眠期（12月10日）達到最高峰，分別為988 ng·g-1和590 ng·g-1；在大、小孢子發(fā)生期（3月1日）ABA 含量最低，雌雄花芽分別是98 ng·g-1和60 ng·g-1。雌、雄花芽IAA含量均呈“上升—下降”的趨勢，且雌花芽IAA含量一直顯著高于雄花芽，但雌、雄花芽IAA 含量均在大、小孢子發(fā)生期達到最高峰，分別是105 ng·g-1和82 ng·g-1；在雌、雄花芽休眠期含量最低，分別是48 ng·g-1和28 ng·g-1。雌、雄花芽ZR含量均呈“下降—上升—下降”的趨勢，且雄花芽ZR 含量一直高于雌花芽，但在雌、雄蕊原基分化期的ZR 含量差異不顯著，其它時期均差異顯著；兩者的ZR 含量均在雌/雄蕊形態(tài)建成期達到最高峰，分別是14 ng·g-1和7 ng·g-1，在雌、雄雄蕊原基分化期含量最低均為3 ng·g-1。此外，杜仲花芽在誘導(dǎo)花器官分化過程中（花序原基分化期至雌、雄蕊原基分化期），IAA 和ZR 含量在花芽中分別是上升和下降的，而ABA 含量在雌、雄花芽的分別是下降和上升的，說明ABA 對杜仲的雌、雄蕊分化可能分別具有抑制和促進作用。

圖3 雌雄花芽不同發(fā)育期激素含量變化Fig.3 Variation of endogenous hormone during different female and male floral development

3 結(jié)論與討論

確定花芽發(fā)育進程時期，可為植物及時采取合理栽培管理措施提供參考，對實踐生產(chǎn)和育種具有指導(dǎo)意義。多種植物花芽分化研究結(jié)果表明，花芽發(fā)育過程中外部形態(tài)與內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)存在著相關(guān)性，徐自龍等研究結(jié)果表明依據(jù)山雞椒Litsea cubeba的外部形態(tài)判斷花芽分化發(fā)育階段是可行的，這為人工授粉等研究適時取材提供了依據(jù)[15]。本研究觀察結(jié)果顯示杜仲花芽分化過程與劉朝暉[6]觀察結(jié)果一致，但是花芽分化時間早于后者，說明不同地區(qū)的氣候條件影響杜仲花芽分化進程。杜仲雌、雄花芽外部形態(tài)特征與其內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)具有一定相關(guān)性，杜仲雌、雄花芽的苞片開始木質(zhì)化、芽體顏色由青綠色變?yōu)榛揖G色時，花芽進入雌雄蕊原基分化期，此時雌、雄蕊原基開始在苞片基部內(nèi)側(cè)產(chǎn)生；第二年，雌、雄蕊開始露出苞葉時，大小孢子進入減數(shù)分裂，當(dāng)雌、雄蕊完全露出苞葉時，雌雄配子體發(fā)育成熟。因此，可依據(jù)杜仲雌、雄花芽的外部形態(tài)判斷花芽發(fā)育階段，在花芽發(fā)育關(guān)鍵時期積極采取管理措施從而促進雌雄花器官和配子體正常發(fā)育。

通過對杜仲雌雄花芽整個發(fā)育過程觀察，杜仲雌、雄花芽在整個發(fā)育過程中無花被片產(chǎn)生，且在一個性別的花芽中觀察不到另一個性別花器官原基發(fā)生的痕跡，其單性花與楊樹Populus deltoides、大麻Cannabis sativa等植物的單性花產(chǎn)生模式一致，即單性花的性別分化發(fā)生在雄蕊和心皮發(fā)育之前[16]。杜仲雌雄花的性別不是由某一個性別花器官退化造成的，雌雄花芽雖在花芽營養(yǎng)階段形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，但此時性別已產(chǎn)生，具有本質(zhì)差異。

植物的開花過程受植物激素調(diào)控，不同內(nèi)源激素對雌雄花芽的促進作用具有差異。本研究對杜仲雌、雄花芽不同發(fā)育時期花芽的ABA、IAA和ZR 含量測定結(jié)果顯示，在花器官啟動過程，杜仲雌雄花芽的IAA 含量均上升、ZR 含量均下降，IAA 和ZR 對雌雄花芽形態(tài)分化具有相似作用，且高含量的IAA 和低含量的ZR 可能對雌、雄蕊的形態(tài)分化可能具有促進作用；然而，此過程中雌花芽的ABA含量下降，而雄花芽的ABA含量上升、且含量顯著高于雌花芽，但在其他發(fā)育時期，雄花芽的ABA 含量均顯著低于雄花芽，說明ABA對雌雄花芽具有不同調(diào)控作用，可能一定含量的ABA 對杜仲雄蕊原基的分化具有促進作用，而雌蕊分化需要低水平的ABA 含量。杜仲雌雄花芽中ABA 和ZR 含量變化趨勢及其含量高峰期與銀杏Ginkogo biloba雌、雄花芽激素變化一致[10-11]。雌雄花芽中激素的差異變化與雌雄花比例甚至植物性別密切相關(guān)，如生長素在黃瓜Cucumis sativus、大麻、柿子Diospyros kaki等植物中促進雌蕊發(fā)育，但對啤酒花Humulus lupulus和青蒿Mercurialias annua等植物的雄蕊發(fā)育具有促進作用和提高雄花比例[17]。脫落酸對植物性器官的影響可通過抵消生長素和赤霉素在植物中雌化或雄化作用[18]。Akagi 等在獼猴桃Actinidia chinensis的Y 染色體上鑒定的性別決定基因SyGI，是一個C 類型的細胞分裂素響應(yīng)基因，具有抑制雌蕊發(fā)育，使植株表現(xiàn)為雄性的功能[19]；甚至，噴施細胞分裂素可使山葡萄Vitis amurensis雄株性別發(fā)生反轉(zhuǎn)[20]。此外，乙烯、赤霉素、茉莉酸等植物激素也可影響植物的花器官分化甚至調(diào)控花性器官的性別轉(zhuǎn)化，但在不同植物中激素調(diào)控花器官作用和影響程度不同[21]。同時，植物的營養(yǎng)供應(yīng)對花芽內(nèi)源激素也具有調(diào)控作用，在油茶花芽前分化期施肥可以提高花芽中的ABA 和ZR 含量，但花芽形態(tài)分化期則降低ABA 含量，促進油茶花芽生長和分化率[22]。但是本研究只是基于3 種激素進行了測定，缺乏乙烯、茉莉酸等其他植物內(nèi)源激素在杜仲雌雄花芽過程中調(diào)控作用研究，同時也需要對雌雄花芽中的營養(yǎng)成分與內(nèi)源激素的關(guān)系進行探索。雖然本研究目前還存在一定局限性，但花芽觀察結(jié)果為杜仲雌雄花器官進程判斷提供了外部形態(tài)依據(jù)，同時內(nèi)源激素的測定結(jié)果也對生產(chǎn)實踐中不同性別植株噴施植物調(diào)節(jié)劑提供了理論依據(jù)。