王 藝，涂桂英

（1.貴州民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

馬尾松Pinus massonianaLamb.是中國南方地區(qū)最主要的用材樹種、造林先鋒樹種[1]及產(chǎn)脂樹種[2]，也是典型的外生菌根樹種[3]，在我國松屬鄉(xiāng)土樹種中分布最廣，速生豐產(chǎn)，適應(yīng)性強(qiáng)[4]，具有良好的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)價值，在我國林業(yè)中具有重要地位，同時對貴州省儲備林建設(shè)也發(fā)揮著重要作用。

一直以來，干旱都是人們關(guān)注的一個重點問題，而干旱也嚴(yán)重影響著植物的生長和發(fā)育?，F(xiàn)如今，干旱已成為我國，特別是西部地區(qū)林業(yè)建設(shè)的重要限制因子之一?？上驳氖且延邢嚓P(guān)研究表明，菌根真菌可通過建立共生關(guān)系，擴(kuò)大根系吸收面積，改善寄主植物的水分狀況和養(yǎng)分代謝，避免或減緩水分脅迫對植物的傷害[5]，促進(jìn)植物生長發(fā)育。外生菌根真菌可增強(qiáng)苗木的抗旱能力[6]，促進(jìn)苗木對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[7]，提高苗木的抗逆性和適應(yīng)能力[8]。目前，雖然在其它植物上利用菌根提高水分利用效率和耐旱性方面已有較多研究[6,9-12]，但在持續(xù)干旱條件下，研究外生菌根真菌對馬尾松幼苗生長、水分代謝和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，以及脅迫解除復(fù)水過程中馬尾松菌根化苗木在生理生化物質(zhì)上的變化，國內(nèi)外尚少見報道。為此，本研究采用盆栽方法，探討持續(xù)干旱及復(fù)水后外生菌根真菌對馬尾松幼苗生長及生理特性的影響，為外生菌根真菌在馬尾松抗旱上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬尾松種子采自貴州省都勻市優(yōu)良林分。本研究供試的5 種菌種由西南大學(xué)黃建國教授提供，分別為：牛肝菌（Sp7）（簡稱S7）、牛肝菌（Sp1）（簡稱S1）（二者都為褐環(huán)乳牛肝菌Suillus luteus）、雞油菌Cantharellus cibarius（簡稱G）、彩色豆馬勃Pisolithus tinctorius（簡稱C）、土生空團(tuán)菌Cenococcum geophilum（簡稱T），不接菌為對照（CK）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌劑制備及培養(yǎng)

平板培養(yǎng)5 個供試菌種。選用MMN 固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)10 d，菌絲長滿后備用。液體擴(kuò)大培養(yǎng)基質(zhì)，采用改良PD 培養(yǎng)基。首先在量程為500 mL 的三角瓶中裝入制備好的培養(yǎng)基，每個三角瓶中裝入300 mL，接著在超凈工作臺內(nèi)分別用直徑1 cm 無菌打孔器切取已培養(yǎng)好的外生菌根菌平板菌落，接種到液體培養(yǎng)基中，每瓶裝5 個菌片，封口。接完種后將其放置25℃培養(yǎng)箱中，約20 d，待菌絲長滿基質(zhì)后，作為菌劑使用[13]。

1.2.2 種子及土壤處理

選取籽粒飽滿無蟲害的馬尾松種子，流水沖洗干凈后，用75%乙醇表面消毒1 min，無菌水沖洗4 次，然后用初始溫度45℃溫水浸種24 h，濕紗布包裹，放到25℃恒溫箱中催芽，待種子裂嘴露白時即可播種。試驗基質(zhì)是由第四紀(jì)紅色黏土發(fā)育的黃壤與干凈的河砂組成，按體積比9∶2比例混合，須在高壓滅菌鍋內(nèi)（壓力0.14 MPa，124～126℃）連續(xù)滅菌2 h 后備用。塑料花盆規(guī)格為250 mm×280 mm，用95%酒精擦拭后晾干。供試土壤的基本理化性質(zhì)見表1。

1.2.3 播種和接種

每盆接入菌絲液1 000 mL。采用點播方式，接種采用“三層接種法”，即首先在試驗盆中裝入1/3 高度的滅菌基質(zhì)，然后均勻地噴灑上一層菌絲液，用量大約是每盆接入量的1/3，之后又撒上一層基質(zhì)至盆高的3/4 處，再噴灑1/3 的菌絲液，覆上一層基質(zhì)，種子播于其上，最后將剩余的菌絲液噴灑于種子周圍，覆土。

表1 供試土壤基本化學(xué)性質(zhì)Table 1 Basic chemical properties of the soil used in the experimental

1.2.4 試驗設(shè)計

采取隨機(jī)區(qū)組試驗，試驗設(shè)5 個接種處理、1個對照處理（不接種），每處理25 盆，每盆4 株，每處理3 次重復(fù)。分別在持續(xù)干旱當(dāng)天（0 d）和持續(xù)干旱第7 天、第14 天、第21 天、第28 天和第35 天進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，同時在持續(xù)干旱的14、21、28 d 對部分苗木進(jìn)行復(fù)水，并在復(fù)水7 d后進(jìn)行取樣調(diào)查，分別用復(fù)水1（R1：持續(xù)干旱14 d 后復(fù)水）、復(fù)水2（R2：持續(xù)干旱21 d 后復(fù)水）和復(fù)水3（R3：持續(xù)干旱28 d 后復(fù)水）表示。干旱程度進(jìn)行分級[14]：濕潤，RSC ≥70%；輕微干旱，55%≤RSC＜70%；中等干旱，45%≤RSC＜55%；嚴(yán)重干旱，35%≤RSC＜45%；極端干旱，RSC＜35%。

1.3 指標(biāo)的測定

3月開始育苗，待苗木長至6 個月時，從大約200 株苗中隨機(jī)抽取20 株進(jìn)行侵染率調(diào)查，觀察發(fā)現(xiàn)接種外生菌根真菌的苗木侵染率達(dá)100%，而未接種的苗木侵染率為0。開始水分脅迫后，每10 d 測定1 次苗高和地徑，直至脅迫試驗結(jié)束。將植株沖洗干凈后，放置80℃烘箱烘至恒質(zhì)量，稱得干質(zhì)量，測定生物量。用Epson 數(shù)字掃描儀（Expression 10000 XL1.0）對不同處理后的根系進(jìn)行掃描，然后對根系形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行定量分析。自由水、束縛水、葉片相對含水量、根系活力、蔗糖、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的測定均參考張志良等[15]及郝建軍等[16]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

選用Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及作圖，運用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，并用Duncan 進(jìn)行多重比較，采用二階聚類分析法篩選出影響菌根抗旱的關(guān)鍵指標(biāo)，并按重要程度從高到低依次排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 持續(xù)干旱及復(fù)水對不同苗木生長的影響

2.1.1 持續(xù)干旱對不同苗木生長的影響

由表2可見，與CK 相比，接種的5 種外生菌根真菌均顯著提高了苗木苗高、地徑、生物量和根冠比（P＜0.05）。其中在苗高方面，接種S1 增幅最大，達(dá)37.8%；S7 次之，達(dá)32.6%。在地徑上，T 增幅最大，達(dá)39.9%；S1 次之，達(dá)36.5%。生物量增加方面效果最佳的是接種S1 和T，均高出對照的50%以上，其接種效果為：S1＞T＞C＞G＞S7。外生菌根真菌對苗木根系及地上部分生長有顯著的促進(jìn)作用，特別是根系生長，增幅最小達(dá)20.9%（C），最大達(dá)34.6%（S1）?？梢?，菌根化馬尾松苗木根冠比顯著高于CK。綜上所述，接種S1 和T 對幼苗在生長上促進(jìn)效果較好，且菌根依賴性最強(qiáng)。

表2 持續(xù)干旱對不同苗木生長的影響?Table 2 Effect of continuous drought to the growth of different seedling

2.1.2 持續(xù)干旱及復(fù)水對不同苗木干物質(zhì)積累和根冠比的影響

由圖1可知，苗木干物質(zhì)積累隨脅迫時間的延長呈先增后降的趨勢，在脅迫21 d 后達(dá)到最大值，其中接種S1 的效果最好，與CK 相比增加了48.3%，菌根化苗木與CK 間存在顯著差異（P＜0.05）。復(fù)水后外生菌根真菌對苗木產(chǎn)生明顯的激發(fā)作用，提高了菌根化苗木干物質(zhì)積累量，且超過復(fù)水前。在持續(xù)干旱14、21、28 d 復(fù)水后（R1、R2、R3），苗木干物質(zhì)積累分別以接種T、G、S7 的增幅最大，達(dá)28.4%、23.3%、19.7%。由此可見，相比長期脅迫，短期脅迫后復(fù)水的補(bǔ)償效應(yīng)更高。

圖1 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木干物質(zhì)的變化Fig.1 Change of biomass to different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

由圖2可知，在持續(xù)干旱前21 d，苗木根冠比無明顯變化，隨著脅迫時間的增加（28～35 d），苗木根冠比逐漸增加，且菌根化苗木根冠比一直高于CK，但無顯著性差異（P＞0.05）。這表明干旱脅迫能夠促進(jìn)苗木根系生長，使根干物質(zhì)積累量增加，根冠比增大。所有處理復(fù)水后的根冠比都小于復(fù)水前，持續(xù)干旱14 d和21 d復(fù)水后（R1，R2），接種G 的苗木降幅最大，分別為37.0%和42.0%；持續(xù)干旱28 d 復(fù)水后（R3），接種S1 的苗木降幅最大，達(dá)36.6%。這可能是由于脅迫后復(fù)水增加了菌根化馬尾松苗木各個器官的干物質(zhì)積累量，況且葉和莖對水分敏感，其干物質(zhì)積累速率大于根。此外，由于速生期（6—8月）菌根化苗木生長重心向地上部分轉(zhuǎn)移，增加了地上部分的干物質(zhì)分配比例，導(dǎo)致根冠比降低。

圖2 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木根冠比的變化Fig.2 Change of R:S ratio to different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

2.2 持續(xù)干旱及復(fù)水對不同苗木根系形態(tài)的影響

由圖3A 可知，持續(xù)干旱下，外生菌根真菌顯著促進(jìn)了苗木根長生長，整個過程中以接種S1 的苗木根長最長，同CK 比增幅最大達(dá)67.4%，最小達(dá)48.5%，且菌根化苗木與CK 間有顯著性差異（P＜0.05）。干旱脅迫誘導(dǎo)根系向下伸長，促使苗木能吸收到更深層土壤的水分，以滿足其生長要求。從圖3A 可看出，脅迫時間越長其根系越長，復(fù)水后根系又進(jìn)一步生長延伸，根長大于復(fù)水前，菌根化苗木根長的生長顯著大于CK，其中以接種S1 的苗木在干旱脅迫14 d 復(fù)水后（R1），增幅最大達(dá)59.6%，這大大增強(qiáng)了菌根化苗木抗倒伏性，增加了后期的耐旱性。

持續(xù)干旱使苗木根粗大大降低，但菌根化苗木根粗一直高于CK，其中接種S1 的苗木在持續(xù)干旱過程中表現(xiàn)出較好的促生效果，與CK 比增幅最大達(dá)44.8%，最小達(dá)24.1%。干旱脅迫14 d 和21 d 復(fù)水后（R1，R2）苗木根粗較復(fù)水前均增加，分別以接種C 和S7 的苗木增幅最大，達(dá)18.3%和13.0%；持續(xù)干旱28 d 復(fù)水后（R3），苗木根粗較復(fù)水前降低，但菌根化苗木降幅小于CK，且菌根化苗木根粗最終高于持續(xù)干旱35 d?？梢?，菌根化苗木在干旱及復(fù)水過程中能表現(xiàn)出較好的促生效果，短歷時（14～21 d）干旱后復(fù)水更利于菌根化苗木的恢復(fù)（圖3B）。

由圖3C—D 可知，馬尾松苗木側(cè)根數(shù)和側(cè)根長隨干旱脅迫強(qiáng)度的增加而逐漸增加，最后趨于平穩(wěn)。整個過程中，菌根化苗木側(cè)根數(shù)和側(cè)根長一直高于CK，其中接種S1 的苗木側(cè)根數(shù)和側(cè)根長最大，與CK 比增幅最大達(dá)122%和204%，最小達(dá)94%和74%，菌根化苗木與CK 間差異極顯著（P＜0.01）。表明在持續(xù)干旱下外生菌根真菌能誘導(dǎo)苗木側(cè)根生長并產(chǎn)生更多側(cè)根，擴(kuò)大根系對水分的吸收范圍，從而提高菌根化苗木抗旱性。復(fù)水后苗木側(cè)根數(shù)和側(cè)根長均有不同程度的恢復(fù)，且菌根化苗木恢復(fù)度大于CK，其中接種S1 的苗木增幅最大，分別為23.5%、7.1%和5.6%。說明在持續(xù)干旱條件下，外生菌根真菌通過促進(jìn)苗木側(cè)根長和側(cè)根數(shù)的生長來適應(yīng)干旱環(huán)境，并在干旱復(fù)水后仍能表現(xiàn)出較好的補(bǔ)償效應(yīng)。

苗木根體積隨干旱脅迫時間的增加而緩慢增加，菌根化苗木根體積一直比CK 高，其中以接種S1 的苗木效果最好，與CK 比增幅最大達(dá)450%，最小達(dá)97%，且菌根化苗木與CK 間差異極顯著（圖3E，P＜0.01）。與復(fù)水前相比，不同干旱脅迫時間復(fù)水后苗木根體積增加，且菌根化苗木增幅大于CK，其中接種T 的苗木增幅最大，分別為39.1%、8.7%和15.8%。

圖3 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木根系形態(tài)變化Fig.3 Change of root to different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

在持續(xù)干旱條件下，外生菌根真菌能增加苗木根系總吸收面積和活躍吸收面積，從而增強(qiáng)苗木根系活力。由圖4可知，隨著脅迫時間的增加，苗木根系總吸收面積和活躍吸收面積均表現(xiàn)出降—升—降的趨勢，以持續(xù)干旱21 d 時苗木根系活力最強(qiáng)，其中接種S1 的苗木根系總吸收面積和活躍吸收面積最大，同CK 相比分別增加了57.0%和48.9%，差異顯著（P＜0.05）?？梢娡馍婢m度的干旱脅迫更能激活苗木自身的抗旱調(diào)節(jié)系統(tǒng)，增強(qiáng)抗旱性。

持續(xù)干旱后復(fù)水，苗木根系總吸收面積和活躍吸收面積都有所恢復(fù)。從圖4A 可看出，復(fù)水后苗木根系總吸收面積增加，且菌根化苗木增幅大于CK，在持續(xù)干旱14、21 和28 d 復(fù)水后，分別以接種S7、S1 和G 的苗木增幅最大，達(dá)14.7%、21.9%和32.9%。從圖4B 可看出，復(fù)水后苗木根系活躍吸收面積增加明顯，同CK 相比，菌根化苗木差異顯著（P＜0.05），持續(xù)干旱14、21 和28 d 復(fù)水后，苗木根系活躍吸收面積較復(fù)水前顯著增加，其中持續(xù)干旱14 d 和21 d 復(fù)水后（R1，R2），以接種S7 的苗木增幅最大，達(dá)254%和143%；持續(xù)干旱28 d 復(fù)水后（R3），以接種S1的苗木增幅最大，達(dá)48%。結(jié)果表明，在持續(xù)干旱復(fù)水后，外生菌根真菌能增加苗木根系吸收面積，提高苗木根系活力，并表現(xiàn)出一定的補(bǔ)償效應(yīng)，其中脅迫14 d 和21 d 復(fù)水后菌根化苗木恢復(fù)效果最好，說明短期輕度干旱鍛煉能有效提高菌根化苗木對干旱脅迫的適應(yīng)能力。

2.3 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木水分代謝的變化

2.3.1 不同苗木葉片相對含水量RWC 和水分飽和虧缺WSD 的變化

干旱脅迫下，植物葉片含水量的變化可以反映植物葉片持水的能力[17]。植物受到干旱脅迫時，該指標(biāo)會隨水分脅迫強(qiáng)度的增加而減少[18]。隨著干旱時間的延長，馬尾松苗木葉片的相對含水量降低，但菌根化苗木的相對含水量一直高于CK，且各處理間差異顯著（圖5A，P＜0.05）。這表明外生菌根真菌在持續(xù)干旱脅迫下可提高馬尾松苗木相對含水量，以此減輕水分脅迫對其造成的影響。

由圖5A 可見，在持續(xù)干旱14 d 后復(fù)水（R1），除接種T外，菌根化苗木相對含水量均超過復(fù)水前，以接S1 的苗木增幅最大，達(dá)48.6%，各處理間差異顯著（P＜0.05）；在持續(xù)干旱21 d 后復(fù)水（R2），苗木相對含水量均顯著增加，各處理間差異顯著（P＜0.05）；在持續(xù)干旱28 d 后復(fù)水（R3），與復(fù)水前相比菌根化苗木相對含水量略有增加，但差異不顯著（P＞0.05）。說明在持續(xù)干旱不同時間復(fù)水后苗木相對含水量有不同程度的提高，表現(xiàn)出一定的補(bǔ)償效應(yīng)，而接種外生菌根真菌后顯著促進(jìn)了這一效應(yīng)。在持續(xù)干旱21 d 后復(fù)水，苗木相對含水量增幅最大，其中接種G、S1、C和T 的苗木補(bǔ)償效應(yīng)最好。

由圖5B 所示，隨著干旱脅迫時間的增加，苗木葉片水分飽和虧缺逐漸上升，而CK 水分飽和虧缺顯著高于菌根化苗木，且在同一脅迫時間內(nèi)各處理間差異顯著（P＜0.05）。這表明外生菌根真菌能顯著降低苗木水分飽和虧缺，從而提高苗木保水力。在干旱脅迫不同時間復(fù)水均能降低苗木水分飽和虧缺（圖5B）。干旱脅迫14 d后復(fù)水（R1），同復(fù)水前相比，苗木水分飽和虧缺下降，且接種G 的苗木降幅最大，為68.5%；干旱脅迫21 d后復(fù)水（R2），菌根化苗木水分飽和虧缺明顯低于復(fù)水前，其降幅大小依次是：S1（74.5%）＞C（67.6%）＞G（66.0%）＞S7（60.5%）＞T（59.0%），由此看出，當(dāng)脅迫時間持續(xù)增加時，菌根化馬尾松苗木維持胞內(nèi)水分平衡的自我保護(hù)能力也逐漸增強(qiáng)。持續(xù)脅迫28 d 后復(fù)水（R3），苗木水分飽和虧缺較復(fù)水前有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。說明干旱復(fù)水后，菌根化苗木比CK 更能顯著降低苗木水分飽和虧缺，提高苗木含水量，增強(qiáng)苗木抗旱性，但隨著干旱脅迫的不斷增強(qiáng)，苗木恢復(fù)能力達(dá)到一定程度后減弱，在干旱脅迫第21 天復(fù)水后恢復(fù)能力最大。

圖4 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木根系活力的變化Fig.4 Change of root vigor to different seedling under continuous drought and rewatering

圖5 持續(xù)干旱及復(fù)水對不同苗木相對含水量和水分飽和虧缺的影響Fig.5 Effect of continuous drought and rewatering to different seedling in RWC and WSD

2.3.2 不同苗木葉片自由水/束縛水的變化

由圖6可見，隨著土壤含水量的降低和脅迫時間的增加，苗木自由水與束縛水的比值先降后增，在持續(xù)干旱21 d 時達(dá)最小，然后逐漸增加，其中菌根化苗木自由水與束縛水的比值均低于CK，以接種S1 的苗木自由水與束縛水的比值最低，較CK 降低了53.9%，可看出在一定干旱脅迫下，外生菌根真菌通過降低自由水含量，相應(yīng)增加束縛水的含量，來增強(qiáng)苗木抗旱能力。

圖6 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木自由水/束縛水的變化Fig.6 Change of free water/bound water to different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

在干旱脅迫的不同時期復(fù)水效果不同，持續(xù)干旱14 d 和21 d 后復(fù)水（R1，R2），菌根化苗木自由水與束縛水的比值都回升，分別以接種S1和S7 的苗木增幅最大，較CK 增加了36.4%和58.2%；而持續(xù)干旱28 d 后復(fù)水（R3），苗木自由水與束縛水的比值降低。說明復(fù)水后外生菌根真菌能增加苗木自由水含量，以促進(jìn)各種正常生理代謝，而長歷時（28 d）脅迫的恢復(fù)能力不如短歷時脅迫（14～21 d）。

2.3.3 不同苗木水勢的變化

如圖7所示，隨著干旱脅迫時間的增加，苗木葉水勢總體呈上升趨勢，而菌根化苗木葉水勢一直顯著低于CK（P＜0.05），其中以接種G 的苗木降幅最大，達(dá)63.9%。當(dāng)苗木受到干旱脅迫時，其水勢呈上升趨勢，復(fù)水后有所恢復(fù)。從圖7可以看出，持續(xù)干旱14 d 后復(fù)水（R1），接種S1、C 和T 的苗木葉水勢較復(fù)水前（14 d）明顯下降，降幅分別為30%、31%和39%，菌根化苗木與CK間差異顯著（P＜0.05）；持續(xù)干旱21 d后復(fù)水（R2），菌根化苗木葉水勢均降低，降幅大小依次是：

T（49.3%）＞S1（43.7%）＞S7（36.0%）＞G（12.2%）＞C（4.4%），同CK 相比，菌根化苗木有顯著性差異（P＜0.05）；持續(xù)干旱28 d后復(fù)水（R3），苗木葉水勢除接種G 和C 外，其他都高于復(fù)水前，且同CK 相比，菌根化馬尾松苗木差異顯著（P＜0.05）?？梢娋缒驹诓煌{迫時間復(fù)水后表現(xiàn)有差異，適度脅迫有利于植物水分的補(bǔ)償作用。

圖7 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木水勢的變化Fig.7 Change of water potential to different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

2.4 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

2.4.1 不同苗木可溶性糖的變化

如圖8所示，在外生菌根真菌作用下，苗木可溶性糖含量增加，同一脅迫時間下菌根化苗木可溶性糖含量比CK 都高。不同水分脅迫時間對菌根化苗木可溶性糖含量的影響不同，當(dāng)持續(xù)干旱時間逐漸增加時，苗木可溶性糖含量先增后降，在干旱脅迫第14 天達(dá)最大，其中接種S1 的含量最高，比CK 提高了33.1%，菌根化苗木與CK 間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖8 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木可溶性糖的變化Fig.8 Change of soluble sugar to different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

復(fù)水對苗木可溶性糖有不同影響，恢復(fù)程度與脅迫時間有關(guān)（圖8）。在持續(xù)干旱14 d 和21 d后復(fù)水（R1，R2），發(fā)現(xiàn)菌根化苗木可溶糖含量較復(fù)水前增加，而CK 可溶糖含量則降低，各菌根化苗木均以干旱14 d 后復(fù)水效果最好，且接種S1的苗木增幅最大，達(dá)13.5%，菌根化苗木同CK 相比差異顯著（P＜0.05）。在持續(xù)干旱28 d 后復(fù)水（R3），苗木可溶性糖含量下降，而CK 降幅最大，達(dá)61.1%，同CK 相比菌根化苗木差異顯著（P＜0.05）。可見，脅迫程度和持續(xù)時間影響著苗木復(fù)水后的補(bǔ)償效應(yīng)，在輕度（14 d）和中度（21 d）干旱脅迫后，外生菌根真菌能增強(qiáng)苗木在復(fù)水后的補(bǔ)償效應(yīng)，并以輕度脅迫后的補(bǔ)償效應(yīng)最大。當(dāng)苗木受到嚴(yán)重脅迫（28 d）后復(fù)水，自我恢復(fù)能力則會減弱，但接種菌根菌可緩解這一情況。

2.4.2 不同苗木蔗糖的變化

由圖9可見，在整個水分持續(xù)干旱期間，菌根化苗木蔗糖含量均高于CK，并隨持續(xù)時間的延長，變化趨勢呈先增后降的單峰曲線，且峰值均出現(xiàn)在脅迫第14 天，其中接種C 的苗木蔗糖含量最高，較CK 提高了15.5%。持續(xù)干旱14 d 后復(fù)水（R1），菌根化苗木蔗糖含量與復(fù)水前（14 d）相比有所增加，增幅大小為G（109.5%）＞S7（28.0%）＞S1（7.3%）＞C（3.4%）＞T（3.3%）；在持續(xù)干旱21 d 和28 d 后復(fù)水（R2，R3），苗木蔗糖含量與復(fù)水前相比（21 d，28 d）有所降低，甚至與極端干旱（35 d）時相近。表明在干旱復(fù)水后，外生菌根真菌能提高苗木蔗糖含量，而復(fù)水后的補(bǔ)償生長效應(yīng)表現(xiàn)為脅迫影響程度越大補(bǔ)償效應(yīng)越小。

圖9 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木蔗糖含量變化Fig.9 Change of sucrose sugar to different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

2.4.3 不同苗木游離脯氨酸的變化

由圖10可見，脯氨酸含量隨脅迫時間的增加呈漸增趨勢，且菌根化馬尾松苗木脯氨酸含量低于CK，其中接種S1 的苗木脯氨酸含量降幅最大，達(dá)66.5%。說明當(dāng)苗木遭受干旱脅迫時，其自身會產(chǎn)生大量游離脯氨酸進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，而外生菌根真菌改善了植株水分代謝，避免過度失水，減輕苗木受脅迫的程度，因此無需菌根化苗木合成更多的脯氨酸進(jìn)行滲透保護(hù)作用。

干旱脅迫不同時間復(fù)水后各處理苗木游離脯氨酸含量變化見圖10。在干旱脅迫14 d 后復(fù)水（R1），菌根化苗木脯氨酸含量較脅迫結(jié)束時（14 d）下降，降幅大小為T（61.9%）＞C（44.4%）＞S7（42.1%）＞S1（16.1%）＞G（0.06%），而CK 較脅迫結(jié)束時（14 d）增加，菌根化苗木同CK 相比有顯著性差異（P＜0.05）；在持續(xù)干旱21 d 后復(fù)水（R2），菌根化苗木脯氨酸含量與復(fù)水前相比顯著降低，降幅大小為S1（80.7%）＞C（76.7%）＞T（75.0%）＞G（56.3%）＞S7（48.4%）；在干旱脅迫28 d 后復(fù)水，苗木脯氨酸含量與復(fù)水前基本持平。由此可見，不同持續(xù)干旱時間復(fù)水后，苗木脯氨酸含量的變化也有差異，短期（14～21 d）干旱脅迫后復(fù)水的補(bǔ)償效應(yīng)明顯高于長期（28 d）干旱脅迫。

圖10 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木游離脯氨酸含量的變化Fig.10 Change of prolineto different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

2.4.4 不同苗木可溶性蛋白的變化

圖11可見，隨干旱脅迫時間的延長，苗木可溶性蛋白含量逐漸下降，但菌根化苗木可溶性蛋白含量一直高于CK，其中接種S1 的苗木增幅最大，達(dá)109%，菌根化苗木同CK 相比有顯著性差異（P＜0.05）?？梢娫诟珊得{迫下，外生菌根真菌能顯著提高苗木可溶性蛋白含量，從而提高苗木滲透調(diào)節(jié)能力，減輕水分逆境造成的代謝受阻，增強(qiáng)苗木抗旱性。

圖11 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木可溶性蛋白的變化Fig.11 Change of solubility protein to different seedling under the condition of continuous drought and rewatering

干旱脅迫解除后苗木可溶性蛋白含量都有一定程度的恢復(fù)（圖11），且菌根化苗木恢復(fù)能力大于CK，并與CK 間差異顯著（P＜0.05）。在持續(xù)干旱14 d 后復(fù)水（R1），接種S7 的苗木可溶性蛋白含量最高，增幅最大達(dá)79.3%；而在持續(xù)干旱21 d 后復(fù)水（R2），接種S1 和C 的苗木可溶性蛋白含量顯著增加，表現(xiàn)出超補(bǔ)償效應(yīng)；在持續(xù)干旱28 d 后復(fù)水，菌根化苗木可溶性蛋白含量仍顯著高于復(fù)水前（28 d），仍表現(xiàn)出一定的補(bǔ)償效應(yīng)，由此可見，馬尾松苗木滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)受干旱脅迫程度影響較大，菌根化苗木可溶性蛋白含量在復(fù)水后能維持在較高水平，以調(diào)節(jié)正常的細(xì)胞代謝活動。而不同菌種復(fù)水后在不同脅迫時間的表現(xiàn)有差異，持續(xù)干旱21 d 后復(fù)水（R2），接種S1 和C 的苗木效果最好。

2.5 持續(xù)干旱及復(fù)水后不同苗木抗旱指標(biāo)的聚類分析

選取菌種、可溶性糖含量、蔗糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、根長、根粗、＞5 cm 側(cè)根數(shù)、＞5 cm 側(cè)根長、根體積、根總吸收面積、根活躍吸收面積、葉片相對含水量、自然水分飽和虧、自由水/束縛水、水勢、根冠比、生物量18 個指標(biāo)，對菌根化馬尾松苗木的抗旱性進(jìn)行綜合評價。

如圖12所示，將18 個指標(biāo)分為兩類，聚類質(zhì)量基本良好。最大類含樣品37 例，占比68.5%；最小類含樣品17 例，占比31.5%，兩者比為2.18。由表3可看出抗旱指標(biāo)的分布特征以及這些指標(biāo)在聚類分析中的重要性，18 個指標(biāo)的重要程度從高到低依次為：側(cè)根數(shù)＞側(cè)根長＞根體積＞根長＞自由水與束縛水比＞可溶性糖含量＞生物量＞菌種＞根冠比＞根活躍吸收面積＞根粗＞根總吸收面積＞脯氨酸含量＞水勢＞蔗糖含量＞自然水分飽和虧缺＞可溶性蛋白含量＞葉片相對含水量。從圖12中可知，5 個菌種中S1 在馬尾松菌根化苗抗旱中作用最大，效果最好，接種S1 的苗木抗旱能力最強(qiáng)。從表3可看出側(cè)根數(shù)、側(cè)根長、根體積以及根長的重要程度較高，它們都屬于根系形態(tài)，說明根系的生長形態(tài)是決定馬尾松菌根化苗抗旱性的關(guān)鍵。

圖12 持續(xù)干旱和復(fù)水后影響苗木抗旱性18 個指標(biāo)的模型概要、聚類質(zhì)量及聚類大小Fig.12 Model summary,cluster quality and cluster size of 18 indexes affecting drought resistance of seedlings under continuous drought and rewatering

3 結(jié)論與討論

本試驗研究結(jié)果表明，在干旱脅迫下，接種外生菌根真菌大大促進(jìn)了苗木根系及地上部分生長，這與王秀麗等[6]及以往[19]的研究結(jié)果一致。接種外生菌根真菌后，苗木的苗高、地徑、生物量及根冠比被明顯提高，其中接種S1 和T 對幼苗在生長上促進(jìn)效果較好，且菌根依賴性最強(qiáng)，其主要原因在于菌根菌能誘導(dǎo)苗木側(cè)根生長并產(chǎn)生更多側(cè)根，擴(kuò)大根系對水分的吸收范圍，提高苗木根系吸收面積，從而提高菌根化苗木抗旱性，這與簡在友等[20]的結(jié)果一致。而且在適度的干旱脅迫下，外生菌根真菌更能激活苗木自身的抗旱調(diào)節(jié)系統(tǒng)，增強(qiáng)抗旱性。

表3 聚類及輸入（預(yù)測變量）重要性?Table 3 Clusters and input (predictor) important

植物的水分狀況直接影響其抗旱性，這是因為植物的水分狀況關(guān)系到細(xì)胞膨壓，酶的活性以及有機(jī)物的分解、合成、轉(zhuǎn)化、運輸和新器官的形成[21]。有研究表明葉片水分飽和虧缺是葉片持水能力的標(biāo)志，也是植物體內(nèi)受旱程度的反映[22]。本試驗結(jié)果表明，干旱脅迫后，菌根真菌顯著降低了苗木水分飽和虧缺，苗木葉水勢總體呈上升趨勢，而菌根化苗木葉水勢一直顯著低于未接種苗木，這與前人的研究結(jié)果一致[21]，說明接種菌根菌提高了苗木含水量，增強(qiáng)了苗木抗旱性，從而減輕水分脅迫造成的傷害，促進(jìn)植物生長發(fā)育。本試驗還顯示菌根化苗木在不同脅迫時間復(fù)水后的表現(xiàn)不同，說明適度脅迫有利于植物水分的補(bǔ)償效應(yīng)。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累可以穩(wěn)定植物體內(nèi)的滲透壓平衡，提高植物保水能力[23]。在試驗中，干旱脅迫下外生菌根真菌提高了苗木可溶性糖含量和蔗糖含量。葉片中可溶性糖含量的積累可使細(xì)胞水勢降低，細(xì)胞內(nèi)外滲透勢差增加，使外界水分有利于向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，從而維持植株生長[24-25]。脯氨酸是苗木主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，本試驗研究顯示，脯氨酸含量隨脅迫時間的延長呈漸增趨勢，但菌根化苗木脯氨酸含量低于未接種苗木，這證實了張中峰等[26]的研究結(jié)果，說明外生菌根真菌改善了植株水分代謝，避免過度失水，減輕苗木受脅迫的程度，因此無需菌根化苗木合成更多的脯氨酸進(jìn)行滲透保護(hù)作用。接種外生菌根真菌也顯著增加了可溶性蛋白含量，從而提高苗木滲透調(diào)節(jié)能力，減輕水分逆境造成的代謝受阻，增強(qiáng)苗木抗旱性。

此外，通過對馬尾松不同苗木抗旱指標(biāo)的二階聚類分析表明，接種S1 的苗木抗旱能力最強(qiáng)，側(cè)根數(shù)、側(cè)根長、根體積以及根長的重要程度最高，可見這幾個指標(biāo)對苗木抗旱具有更為關(guān)鍵的作用。因為根系對土壤水分反應(yīng)敏感，干旱脅迫誘導(dǎo)根系向下伸長，使其能吸收更深層土壤的水分，以滿足苗木生長需求。側(cè)根數(shù)量越多、側(cè)根長度越長，就越利于擴(kuò)大根系對水分的吸收范圍，從而提高菌根化馬尾松苗木抗旱性。

綜上所述，持續(xù)干旱及復(fù)水后外生菌根能夠促進(jìn)馬尾松苗木生長，促進(jìn)其根系形態(tài)形成，改善水分利用狀況，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，其中接種S1 的苗木抗旱能力最強(qiáng)，而根系形態(tài)是影響馬尾松不同苗木抗旱性的關(guān)鍵指標(biāo)。目前，本試驗僅從干旱復(fù)水對馬尾松菌根化苗木生理特性進(jìn)行了研究，在細(xì)胞水平上菌根化苗木是如何響應(yīng)干旱脅迫、其分子機(jī)制是怎樣以及抗旱基因有哪些等問題，均有待于做進(jìn)一步深入研究，以便為馬尾松菌根化苗木定向培育及育種提供理論依據(jù)和基因資源，為菌根技術(shù)的開發(fā)和利用提供技術(shù)支撐。