戴 青，韓寧寧，王 軒，楊秀玉，趙 暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

硫酸安普霉素是一種動(dòng)物專用的氨基糖苷類抗菌藥物，《中國獸藥典》2015年版一部[1]收載了硫酸安普霉素及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中含量測定項(xiàng)均采用抗菌藥物微生物檢定法進(jìn)行測定。目前，國際上通用的抗菌藥物微生物檢定法包括管碟法和濁度法，管碟法是各國藥典收載的經(jīng)典抗菌藥物微生物檢定通用方法。不確定度評定是通過對實(shí)驗(yàn)過程各個(gè)環(huán)節(jié)引入的不確定度進(jìn)行評估，以分析各因素對測定結(jié)果的影響[2]。檢測結(jié)果的可靠性很大程度上取決于測量不確定度大小，測量不確定度越小，說明檢測水平越高，檢測結(jié)果的使用價(jià)值越大[3-4]。測量不確定度對于實(shí)驗(yàn)室間比對、測量結(jié)果臨界值的判斷、方法的確認(rèn)及檢測工作國際化等方面都具有重要意義[5-6]。本文根據(jù)JJF1059-2019《測量不確定度評定與表示》[7]中有關(guān)規(guī)定，對管碟法測定硫酸安普霉素可溶性粉中硫酸安普霉素含量的不確定度進(jìn)行了分析與評估，以期為準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)測量結(jié)果與評價(jià)檢測報(bào)告提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ZY-300IV抗菌藥物效價(jià)測量儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)；AX-205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；恒溫培養(yǎng)室；安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，效價(jià)測定用，517單位/mg，批號：K0231610)；硫酸安普霉素可溶性粉供試品(山西新世紀(jì)生物制藥有限公司，批號：190401，規(guī)格：100 g︰10 g(1000萬單位))；抗菌藥物Ⅰ號培養(yǎng)基(北京中海生物科技有限公司)；枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取硫酸安普霉素可溶性粉供試品250 mg，置25 mL容量瓶中，加滅菌水溶解并稀釋制成每1 mL中約含1000單位的溶液。精密量取該溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中約含100單位的溶液。再分別量取100單位/mL的溶液5 mL，分別置50、100 mL量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為10單位/mL和5單位/mL的溶液，作為供試品溶液的高、低劑量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品48 mg，置25 mL容量瓶中，加滅菌水溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中約含1000單位的溶液，稀釋步驟同供試品溶液。

1.2.3 雙碟的制備與培養(yǎng) 取平底雙碟約8套(n)，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20 mL，放置水平臺(tái)上使凝固，作為底層。另取加熱融化后的培養(yǎng)基適量，放冷至50 ℃，加入枯草芽孢桿菌的菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5 mL，攤布均勻，作為菌層。冷卻后，在每一雙碟中以等距離安置不銹鋼小管4(k)個(gè)，待用。將上述稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液分別滴加于不銹鋼小管內(nèi)，在35～37 ℃恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)16～18 h。

1.2.4 抑菌圈直徑的測定與效價(jià)計(jì)算 取出培養(yǎng)好的雙碟，用抑菌圈測量儀測量各個(gè)抑菌圈的直徑，照《中國獸藥典》2015年版一部附錄1431生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的2.2法進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)與效價(jià)計(jì)算。當(dāng)可靠性檢驗(yàn)結(jié)果為回歸非常顯著(P<0.01)與偏離平行不顯著(P>0.05)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才成立。

2 結(jié)果與分析

抑菌圈直徑測定時(shí)，對供試品溶液進(jìn)行掃描測定，測定結(jié)果見表1。

2.2 不確定度來源分析 對抗菌藥物微生物檢定法的二劑量管碟法測量不確定度來源進(jìn)行分析，可將影響硫酸安普霉素效價(jià)測定的不確定度因素歸為：抑菌圈直徑重復(fù)測量的不確定度，抑菌圈測量儀的不確定度，配制溶液(包括稱量、稀釋、定容等操作)的不確定度以及重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度。

表1 抑菌圈直徑測量結(jié)果

2.3 各分量的不確定度

2.3.1 抑菌圈直徑重復(fù)測量的不確定度分量 對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)上述公式計(jì)算效價(jià)(y)為102.95單位/mg，同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析得自由度f=(k-1)(n-1)=21，其合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差即標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(x1)rel=u(x1)/y=0.080/102.95=0.00078。

u(x2)rel=u(x2)/x=0.012/19=0.00063。

2.3.3 配制溶液的不確定度分量 分為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制與供試品溶液的配制。

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液稀釋過程中主要使用的是A級玻璃量器，由單個(gè)玻璃量器體積引入的合成不確定度為

A級100、50、25 mL單標(biāo)線容量瓶的允許誤差分別為：±0.10、±0.05、±0.03 mL，以B類不確定度計(jì)算，按三角分布估計(jì)，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

uv1=0.10/6=0.04 mL，uv2=0.05/6=0.02 mL，uv3=0.03/6=0.01 mL。

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

uv1rel=0.04/100=0.0004，uv2rel=0.02/50=0.0004，uv3rel=0.01/25=0.0004。

配制溶液時(shí)，實(shí)驗(yàn)室溫度接近21 ℃，容量器皿校準(zhǔn)溫度為23.8 ℃，近似于矩形分布。

使用100 mL容量瓶、50 mL容量瓶、25 mL容量瓶，因此，定容體積的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

= 0.0009

2.3.3.2 供試品溶液的不確定度 定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度同標(biāo)準(zhǔn)品溶液定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，移取溶液的不確定度分量同標(biāo)準(zhǔn)品溶液移取溶液的不確定度，供試品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量的不確定度，供試品質(zhì)量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：0.017/250.50=0.00007。

2.3.3.3 配制溶液的不確定度

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度 結(jié)果如表2所示。重復(fù)性試驗(yàn)取供試品兩份，同時(shí)操作，用極差評定相對不確定度：

表2 硫酸安普霉素效價(jià)重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果

=0.0085。

2.4 總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

0.0088。

2.5 擴(kuò)展不確定度Uu(x)/x=0.0088，x=103.65單位/mg，u(x)=0.0088×103.65 =0.91單位/mg。本試驗(yàn)采用置信概率為95%的包含因子，根據(jù)t分布表，取k=2，則擴(kuò)展不確定度為U=2u(x)=2×0.91=1.8單位/mg。硫酸安普霉素效價(jià)測定的結(jié)果可表示為：(103.6±1.8)單位/mg(k=2)。

3 討論與結(jié)論

參照《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[8]，二劑量管碟法加樣順序?yàn)椋焊邼舛葮?biāo)準(zhǔn)品溶液→高濃度供試品溶液→低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液→低濃度供試品溶液，每次滴加的溶液應(yīng)為同一濃度。由加樣時(shí)間引入的不確定度對測定結(jié)果的影響為系統(tǒng)誤差，在試驗(yàn)中，應(yīng)盡量減少加樣時(shí)間，以將該因素的影響控制在最小，在不確定度評定中做零項(xiàng)處理[9-10]。

綜上，各因素對測定結(jié)果的影響依次為：重復(fù)性試驗(yàn)>溶液稀釋>抑菌圈直徑重復(fù)測量>抑菌圈測量儀>樣品稱量。由此可見，本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品與供試品稱量引入的不確定度最小，儀器引入的不確定度次之，而測量不確定度的主要來源為重復(fù)性試驗(yàn)，其次為溶液的稀釋過程，提示試驗(yàn)人員應(yīng)注意效價(jià)測定過程中稀釋定容的操作過程，并注意保持重復(fù)性試驗(yàn)條件的一致性，可采用四分法取樣以保證試驗(yàn)樣品的均勻性。通過對硫酸安普霉素效價(jià)的不確定度評定，有助于準(zhǔn)確衡量檢測結(jié)果，為提高抗生素效價(jià)測定結(jié)果的準(zhǔn)確度提供了參考依據(jù)。