漆世華，秦紅剛，韓 興，李晶梅，熊 亮，石寶蘭，謝紅玲

(國藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司，武漢 430075)

豬瘟是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，對全世界的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大威脅。不同年齡、性別和品種的豬均能感染，死亡率高達(dá)80%～90%。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病之一，我國將其列為一類動(dòng)物傳染病[1]。豬瘟兔化弱毒疫苗是國際上公認(rèn)的、安全有效的預(yù)防豬瘟的弱毒疫苗，也是在我國應(yīng)用最廣泛的豬瘟疫苗。該疫苗推出至今其生產(chǎn)工藝經(jīng)歷了升級換代過程，從組織毒疫苗、原代細(xì)胞毒疫苗到傳代細(xì)胞毒疫苗等[2]。目前，傳代細(xì)胞苗主要采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，每個(gè)轉(zhuǎn)瓶均是獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)單元，每瓶細(xì)胞的質(zhì)量、病毒含量都有差異，導(dǎo)致疫苗批間差異大，而且操作勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率低，有必要盡早轉(zhuǎn)型為生產(chǎn)規(guī)模更大、集約程度更高的生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝。

1967年Wezel[3]首先應(yīng)用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，此后這一技術(shù)得到迅速發(fā)展。生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)由于具有較大表面積、細(xì)胞產(chǎn)量高、培養(yǎng)環(huán)境便于檢測和控制等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于狂犬病、脊髓灰質(zhì)炎等疫苗[4-5]的生產(chǎn)。本研究以ST細(xì)胞為宿主細(xì)胞，采用微載體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行豬瘟抗原的培養(yǎng)工藝進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步利用生物反應(yīng)器工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)豬瘟疫苗提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒和培養(yǎng)基 ST細(xì)胞、豬瘟兔化弱毒(簡稱“豬瘟病毒”)為國藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司保存；MEM、DMEM/F12、DMEM培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；新生牛血清為內(nèi)蒙古金源康公司產(chǎn)品。

1.2 微載體 cytodex1，GE公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器設(shè)備 NBS BioFlo310型生物反應(yīng)器,培養(yǎng)體積10 L,購于NBS公司；一控四平行生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體積2 L，50 L生物反應(yīng)器，購于廣州齊志生物工程設(shè)備有限公司。

1.4 抗體 豬瘟單抗為JBT公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG-FITC為Thermo公司產(chǎn)品。

1.5 細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備 從液氮罐中取出凍存的ST細(xì)胞，復(fù)蘇后在T25方瓶中靜止培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后，用0.25%胰酶消化分散細(xì)胞，按1∶4～1∶5的比例傳代，如此連續(xù)擴(kuò)繁細(xì)胞至所需數(shù)量，用0.25%胰酶消化分散細(xì)胞為ST細(xì)胞懸液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞最佳接種密度的確定 按照3 g/L的使用濃度稱取cytodex1微載體，加入PBS水化8 h，121 ℃ 30 min高壓滅菌。用DMEM/F12培養(yǎng)基置換掉PBS，補(bǔ)充新生牛血清至終濃度10%，加入到2 L生物反應(yīng)器。分別以每個(gè)cytodex1微載體5、15、30個(gè)細(xì)胞的密度接種ST細(xì)胞懸液，進(jìn)行生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)。生物反應(yīng)培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定為：攪拌速度50 r/min、pH7.2、溶氧50%、溫度37 ℃。每天取樣觀察細(xì)胞的生長情況，計(jì)數(shù)細(xì)胞的密度，繪制細(xì)胞的生長曲線，以確定ST細(xì)胞的最佳接種密度。

1.7 細(xì)胞消化放大工藝參數(shù)的確定 待2 L生物反應(yīng)器細(xì)胞的密度達(dá)到2.0×106/mL，將長滿細(xì)胞的微載體收集到細(xì)胞消化瓶中。用pH7.20.01 mol/L的PBS洗滌細(xì)胞2次。每克微載體加入100 mL 37 ℃預(yù)熱的0.25%胰酶消化液進(jìn)行消化，并于消化后3 min、6 min、9 min、12 min取樣觀察細(xì)胞分散、變圓的情況。待細(xì)胞變圓但尚未與微載體脫離時(shí)，排出細(xì)胞消化瓶中的胰酶溶液，加入含10%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。震動(dòng)細(xì)胞消化瓶，使細(xì)胞充分分散、脫離微載體，成為細(xì)胞懸液和微載體的混合物。將混合物接種到10 L生物反應(yīng)器，每日取樣確定細(xì)胞生長情況。

1.8 病毒增殖最佳培養(yǎng)基的確定 采用3 g/L微載體，每個(gè)cytodex1微載體15個(gè)細(xì)胞的密度接種ST細(xì)胞懸液，分別用含10%新生牛血清的DMEM、MEM和DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行ST細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到1.5×106/mL時(shí)，分別更換為含2%新生牛血清的DMEM、MEM和DMEM/F12培養(yǎng)基的病毒維持液，按照0.05 MOI接種豬瘟病毒，培養(yǎng)4 d，進(jìn)行病毒第一次收獲，以后每隔3 d收獲并更換相應(yīng)的病毒維持液，共收獲6次。測定各收次豬瘟病毒的細(xì)胞半數(shù)感染量[6]，判定病毒增殖的最佳培養(yǎng)基。

1.9 病毒最佳接毒量的確定 采用3 g/L微載體和DMEM/F12培養(yǎng)基，每個(gè)cytodex1微載體15個(gè)細(xì)胞的密度接種ST細(xì)胞懸液，進(jìn)行ST細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到1.5×106/mL時(shí)，分別按照0.01、0.05、0.15MOI接種豬瘟病毒，培養(yǎng)4 d，進(jìn)行病毒第一次收獲，以后每隔3 d收獲換液一次，共收獲6次。測定各收次豬瘟病毒的細(xì)胞半數(shù)感染量[6]，確定病毒增殖的最佳接毒量。

1.10 病毒最佳培養(yǎng)條件的驗(yàn)證和穩(wěn)定性研究 用1.6項(xiàng)確定細(xì)胞最佳接種密度、1.8項(xiàng)確定的細(xì)胞最佳培養(yǎng)基，在10 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)ST細(xì)胞，待細(xì)胞長滿微載體后，按1.7項(xiàng)確定的消化工藝參數(shù)將ST細(xì)胞消化放大至50 L生物反應(yīng)器中，按1.9項(xiàng)確定的接毒量接種豬瘟病毒，培養(yǎng)4 d，進(jìn)行病毒第一次收獲，以后每隔3 d收獲并更換相應(yīng)的病毒維持液，共收獲6次。取樣檢測豬瘟病毒含量[6]，并選取部分樣品測定家兔感染量(RID)。將本工藝再重復(fù)驗(yàn)證2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞最佳接種密度的確定 將ST細(xì)胞分別以每個(gè)cytodex1微載體5、15、30個(gè)細(xì)胞的密度接種，進(jìn)行生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在各接種密度的細(xì)胞在接種后3 h，95%細(xì)胞貼附上微載體，并開始伸展(圖1)。每個(gè)cytodex1微載體接種15個(gè)細(xì)胞，在培養(yǎng)第4天細(xì)胞密度達(dá)2.4×106/mL(圖2)，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，維持時(shí)間長；每個(gè)cytodex1微載體接種5個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)第6天細(xì)胞密度才能達(dá)到高峰，由于有20%的空球，細(xì)胞密度也相對較低；每個(gè)cytodex1微載體接種30個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)3 d細(xì)胞密度即達(dá)高峰，但細(xì)胞老化快，部分提前脫落。因此確定細(xì)胞的最佳接種密度每個(gè)cytodex1微載體接種15個(gè)細(xì)胞。

圖1 細(xì)胞在微載體上的生長情況

圖2 不同細(xì)胞密度接種細(xì)胞增殖曲線

2.2 細(xì)胞消化放大工藝參數(shù)的確定 采用細(xì)胞消化瓶，消化6 min，細(xì)胞完全分散(圖3)，將2 L生物反應(yīng)器消化分散的細(xì)胞懸液接種到10 L生物反應(yīng)器，24 h 95%以上的細(xì)胞貼于微載體上，培養(yǎng)4 d，細(xì)胞密度可達(dá)2.8×106/mL，表明此消化放大參數(shù)合適、操作可行。

2.3 病毒增殖最佳培養(yǎng)基的確定 分別采用DMEM、MEM和DMEM/F12三種培養(yǎng)基進(jìn)行豬瘟病毒培養(yǎng)，確定培養(yǎng)基對病毒增殖的影響，培養(yǎng)4 d(1收)細(xì)胞生長狀況良好，形成致密的單層，第2收細(xì)胞更加致密，但從第3收開始，DMEM和MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞逐漸有老化脫落的細(xì)胞，至第4收細(xì)胞脫落明顯，出現(xiàn)約30%的微載體空球，后續(xù)死亡細(xì)胞增多，pH升高，耗氧量降低，未完成5收、6收；DMEM/F12培養(yǎng)的細(xì)胞全程均維持較好的狀態(tài)，收獲的抗原病毒含量也能達(dá)到較高的水平(表1)。因此確定病毒增殖最佳培養(yǎng)基為DMEM/F12。

A:胰酶消化前；B:胰酶消化6 min振搖分散后；C：放大培養(yǎng)24 h

表1 不同培養(yǎng)基對豬瘟病毒增殖的影響

2.4 病毒最佳接毒量的確定 0.01、0.05、0.15 MOI三個(gè)接種量接種豬瘟病毒，取樣檢測豬瘟病毒含量(圖4)。0.05 MOI和0.15 MOI接毒，收獲的抗原病毒含量相當(dāng)，可以達(dá)到7.5 lgTCID50/mL，考慮到0.05 MOI用毒量較少，生產(chǎn)中可以節(jié)約種毒，確定最佳接毒量為0.05 MOI。

圖4 不同接毒量對病毒增殖的影響

2.5 病毒最佳培養(yǎng)條件的驗(yàn)證和穩(wěn)定性研究 采用優(yōu)化的工藝參數(shù)，即cytodex1微載體濃度為3 g/L，每個(gè)cytodex1微載體15個(gè)細(xì)胞的密度接種ST細(xì)胞懸液于10 L生物反應(yīng)器，采用DMED/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到2.0×106/mL，按上述確定的消化工藝參數(shù)將ST細(xì)胞消化放大至50 L生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)3 d，細(xì)胞密度達(dá)到1.5×106/mL，并接種豬瘟病毒。先后培養(yǎng)3批，驗(yàn)證工藝條件的可靠性和穩(wěn)定性。3批病毒增殖差異不明顯(圖5)，從第2收開始，病毒的含量不低于7.0 lgTCID50/mL，最高可達(dá)7.6 lgTCID50/mL；選取了第一批的1～4收樣品進(jìn)行了兔體感染量的測定，2～4收樣品均不低于400萬RID/mL，說明確定的工藝參數(shù)使用效果好且穩(wěn)定。

圖5 工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證

3 討論與結(jié)論

微載體培養(yǎng)具有較高的比表面積，培養(yǎng)條件可控等顯著優(yōu)點(diǎn)，懸浮培養(yǎng)工藝已經(jīng)成為當(dāng)前生物制品研發(fā)、生產(chǎn)的首選工藝[7]。本研究采用cytodex1微載體，每克表面積為4400 cm2，相當(dāng)于1個(gè)15 L轉(zhuǎn)瓶的表面積，同時(shí)這種固體實(shí)心的微載體有利于細(xì)胞貼壁、伸展和病毒的感染[8]，應(yīng)用前景廣闊。

對于大多數(shù)微載體培養(yǎng)來說，一般適宜的細(xì)胞接種密度是每個(gè)微載體8～12個(gè)細(xì)胞。本研究中發(fā)現(xiàn)ST細(xì)胞采用高密度接種時(shí)，細(xì)胞貼壁后能夠很快的伸展，并快速進(jìn)入到對數(shù)生長期；而低密度接種，細(xì)胞要經(jīng)歷一個(gè)較長的生長期才能達(dá)到最高的密度，其細(xì)胞的最高密度和生理狀態(tài)明顯要低于高密度接種，這可能與ST細(xì)胞的平板效率有關(guān)。

對于豬瘟病毒來說，病毒的產(chǎn)量主要取決于培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞的密度和細(xì)胞狀態(tài)，而細(xì)胞貼壁、細(xì)胞接種密度、微載體濃度、營養(yǎng)的供應(yīng)、攪拌速度等培養(yǎng)參數(shù)和培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞的生理狀態(tài)和最終的細(xì)胞密度均有直接影響，從而影響病毒的產(chǎn)量。本研究采用3 g/L的微載體濃度，發(fā)現(xiàn)DMEM/F12相比DMEM和MEM，能夠長時(shí)間維持細(xì)胞較好的生長狀態(tài)，至少可以進(jìn)行病毒的6次收獲，說明在生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)過程中，選擇合適的培養(yǎng)基，為細(xì)胞提供充足均衡的營養(yǎng)至關(guān)重要。

生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)放大是目前公認(rèn)的技術(shù)難點(diǎn)，目前國內(nèi)大多數(shù)企業(yè)在培養(yǎng)中采用的種子細(xì)胞主要是通過轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，一次接種需要多個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞，每個(gè)轉(zhuǎn)瓶都是一個(gè)獨(dú)立的單元，很容易造成培養(yǎng)的污染，無法滿足更大單位體積培養(yǎng)的需要。本研究對微載體的胰酶消化放大培養(yǎng)作了探索，完成了10 L到50 L的放大，并且工藝條件穩(wěn)定，培養(yǎng)三批，從第二收開始病毒含量均不低于7.0 lgTCID50/mL，同時(shí)也進(jìn)行了部分樣品的兔體感染量的測定，不低于400萬RID/mL，為工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。