劉 瑩，楊承槐，陳小云，王 磊

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

牛支原體(Mycoplasmabovis)能引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎以及乳腺炎等多種疾病，嚴(yán)重危害著養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展[1]。牛支原體由Hale等于1961年首次從美國(guó)的乳腺炎牛奶中分離到，隨后在全世界大多數(shù)養(yǎng)牛國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道[2]。我國(guó)自2008年分離到牛支原體并證實(shí)了我國(guó)存在牛支原體肺炎疫情以來[3]，全國(guó)多個(gè)地區(qū)均有報(bào)道，已給我國(guó)的養(yǎng)牛業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

由于牛支原體沒有細(xì)胞壁，其對(duì)常規(guī)的抗菌藥物青霉素不敏感，且對(duì)其它的抗菌藥物易產(chǎn)生耐藥性[5]。因此，疫苗免疫成為預(yù)防牛支原體病的重要方向。然而，目前還沒有商品化的牛支原體疫苗，這主要與牛支原體的致病機(jī)制和免疫機(jī)制不清楚、缺少疫苗評(píng)價(jià)動(dòng)物模型等有關(guān)。為此，本研究從疑似牛支原體感染的牛肺組織中分離并鑒定出一株牛支原體，并分析了該分離株對(duì)牛的致病性。

1 材料與方法

1.1 病料 采集內(nèi)蒙某牛場(chǎng)患嚴(yán)重肺炎的病死牛病變肺臟組織2份。病牛表現(xiàn)精神沉郁，采食量下降，膝關(guān)節(jié)腫大，流鼻涕，呼吸困難，消瘦等。

1.2 主要試劑 支原體基因組提取試劑盒、premix Taq version 2.0、DNA Marker購自Takara公司；馬血清購自Gibco公司；支原體生化鑒定管購自青島海博生物；支原體EZH液體培養(yǎng)基、支原體EZH固體培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制；牛支原體抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購自Biovet公司。

1.3 引物合成 根據(jù)已有的研究報(bào)道[6]，設(shè)計(jì)合成牛支原體特異性引物對(duì)(P48-F/ P48-R)和牛支原體16S rRNA引物對(duì)(SF/SR)。引物序列如下：P48-F: 5’-CGAACCTAAAAAGGGTGAATTAGCATCTT -3’；P48-R: 5’-ATTACTGAGTTAATAGCAGCAACTGCAACG-3’；SF:5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’；SR：5-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 牛支原體的分離培養(yǎng) 無菌條件下將采集的肺組織切成小塊，取約1 g肺組織加入2 mL含雙抗的PBS，研磨后1000 r/min 離心5 min，上清用0.45 μm濾膜過濾，加入支原體EZH液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48 h進(jìn)行一次傳代，取培養(yǎng)基顏色變黃且不渾濁者傳至3代后，取100 μL涂布支原體EZH固體培養(yǎng)基表面，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5 d后，肉眼觀察菌落生長(zhǎng)情況并在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)克隆接種液體培養(yǎng)基，待生長(zhǎng)后再接種固體培養(yǎng)基，進(jìn)行至少3次克隆純化獲得純培養(yǎng)物。

1.5 生化實(shí)驗(yàn)鑒定 使用生化鑒定管進(jìn)行發(fā)酵葡萄糖試驗(yàn)、水解精氨酸試驗(yàn)以及分解尿素試驗(yàn)。

1.6 分子生物學(xué)鑒定 將1.4中克隆純化后的疑似支原體菌落接種支原體液體培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，吸取牛支原體培養(yǎng)菌液2 mL，8000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，用支原體基因提取試劑盒提取DNA，然后取基因組DNA 2 μL作為模板加到如下反應(yīng)體系中(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 μmol/L)4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，Taq酶1 μL，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，57退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳檢測(cè)，其中，選用P48-F/P48-R和SF/SR兩套引物分別擴(kuò)增，將SF/SR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序后，在NCBI中進(jìn)行比對(duì)。

1.7 致病性試驗(yàn) 選用牛支原體抗體陰性的6月齡犢牛4頭，隨機(jī)平均分為感染組和對(duì)照組2個(gè)組，每組2頭牛。感染組每頭牛經(jīng)氣管注射牛支原體培養(yǎng)液6 mL(支原體濃度為109CFU/mL)。對(duì)照組注射等量培養(yǎng)基。連續(xù)觀察21 d，記錄每組牛的臨床癥狀，如有牛死亡則立即進(jìn)行剖檢并采集病料。攻毒21 d后，剖殺所有試驗(yàn)牛，剖檢觀察大體病理變化和肺部組織病理變化，采集病料并進(jìn)行支原體分離鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原的分離 2份病料組織中，001樣品在接種液體培養(yǎng)基3 d后開始變黃且透亮，將液體培養(yǎng)基接種到固體培養(yǎng)基3 d后，出現(xiàn)針尖大小的菌落，普通光學(xué)顯微鏡下菌落均呈“荷包蛋狀”(圖1)，圓形，中央部分較厚，有中心臍。將該純培養(yǎng)物標(biāo)記為牛支原體NM001。

圖1 分離株的菌落形態(tài)(200×)

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 生化管實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，牛支原體分離株NM001不能發(fā)酵葡萄糖，不能水解精氨酸，不分解尿素。與已報(bào)道牛支原體生化特性相符。

2.3 支原體分離株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果與序列分析 如圖2所示，利用牛支原體特異性引物對(duì)P48-F/P48-R擴(kuò)增出牛支原體P48基因片段大小約為543 bp，與預(yù)期片段大小相符。

M: DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 牛支原體NM001株

利用引物對(duì)SF/SR成功擴(kuò)增出大小約1390 bp的單一目的條帶(圖3)，與預(yù)期片段大小相符。測(cè)序結(jié)果表明，該片段為牛支原體的16S rRNA基因序列，與牛支原體Ningxia-1 株(GenBank: CP023663.1)的相似性為99.03%。

2.4 牛支原體NM001株對(duì)牛的致病性試驗(yàn)結(jié)果在攻毒后21 d的觀察期內(nèi)，感染組2頭牛分別在攻毒后第2天和第3天出現(xiàn)體溫上升(0.5～0.8 ℃)，并分別維持2 d和3 d后下降至正常水平，對(duì)照組2頭牛體溫?zé)o明顯變化。從第7天開始，感染組1頭牛出現(xiàn)輕微咳嗽、呼吸急促、喘氣等癥狀，從第10天開始，感染組兩頭牛均流出漿液性鼻液。對(duì)照組兩頭牛均無上述臨床癥狀。

攻毒后21 d剖檢，可見感染組胸腔中少量淡黃色滲出液，肺臟局部形成肝變區(qū)，顏色由紅至灰黑色。其中感染組1號(hào)?？梢姺尾啃纬扇鈽訉?shí)變，并明顯回縮(圖4a)；2號(hào)牛可見肺部顏色變?yōu)榛液谏?，觸感變硬(圖4b)。對(duì)照組2頭牛肺臟均外觀正常。

對(duì)照組的肺組織病料均未分離到支原體，感染組的肺組織病料中均分離到牛支原體，菌落形態(tài)、生化試驗(yàn)、PCR鑒定結(jié)果與接種株一致。

a, b: 攻毒組; c,d: 對(duì)照組

3 討論與結(jié)論

牛支原體(M.bovis)是一種基因組較小(約為1030 kb)、無細(xì)胞壁的微生物。目前，除了最常見的牛支原體外，能感染牛的支原體還有多達(dá)10余種[7]。其中，無乳支原體與M.bovis能出現(xiàn)交叉免疫反應(yīng)，且生化特性較為相似。為此，需要使用分子生物學(xué)診斷技術(shù)來準(zhǔn)確區(qū)分二者[8]。本實(shí)驗(yàn)利用支原體EZH液體培養(yǎng)基、支原體EZH固體培養(yǎng)基，采用形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)鑒定以及分子生物學(xué)方法，最終確定從內(nèi)蒙地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的牛病變肺臟組織中分離到的菌株為牛支原體。

雖然16S rRNA基因在細(xì)菌分類學(xué)上具有重要意義，但由于M.bovis與無乳支原體的16S rRNA 基因的同源性很高，導(dǎo)致無法通過該基因來區(qū)分以上兩種支原體[8]。為此，我們首先對(duì)分離株進(jìn)行M.bovis的一種特異性的、相對(duì)保守的表面脂蛋白抗原(P48 蛋白)[8]的編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，出現(xiàn)目的條帶后再對(duì)分離株的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，最終利用16S rRNA基因序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示NM001株與中國(guó)寧夏分離株Ningxia-1同源性最高，屬于國(guó)內(nèi)流行株。

牛支原體能夠在牛體持續(xù)存在且具有條件性致病的特點(diǎn)[9]，這使某區(qū)域一旦出現(xiàn)牛支原體感染就很難清除，并且牛支原體會(huì)在一定區(qū)域內(nèi)廣泛流行。對(duì)于牛支原體病沒有特效藥，防治該病還應(yīng)依靠疫苗接種。但是，自1961年第一株牛支原體被成功分離到現(xiàn)在，還沒有可廣泛使用的疫苗。目前，牛支原體疫苗的研究主要分為亞單位疫苗、滅活疫苗以及弱毒疫苗三類[10]。其中，亞單位疫苗的研究主要集中于可變表面蛋白(Vsps)以及GAPDH(GapC)蛋白，但目前還未找到免疫保護(hù)性理想的蛋白；對(duì)于牛支原體滅活疫苗的研究較多：有研究者利用一種安全性良好的牛支原體滅活疫苗免疫牛，采用強(qiáng)毒力的牛支原體攻毒后，接種疫苗的犢牛幾乎沒有呼吸道癥狀，而所有未接種疫苗的犢牛都出現(xiàn)了肺炎的癥狀。與接種疫苗的犢牛相比，未接種疫苗的犢牛不僅體溫明顯升高，體重顯著下降，而且出現(xiàn)明顯肺部病變[11-12]。然而，也有研究者發(fā)現(xiàn)牛支原體滅活疫苗的接種雖然能夠使?fàn)倥．a(chǎn)生很高水平的抗體，但仍無法預(yù)防牛支原體引起的關(guān)節(jié)炎[13]。此外，牛支原體滅活疫苗也無法預(yù)防牛支原體引起的乳腺炎，甚至疫苗的接種使乳腺炎癥狀更加嚴(yán)重[14]；在牛支原體弱毒疫苗的研究方面，我國(guó)的研究水平領(lǐng)先于世界。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，將我國(guó)牛支原體HB0101株在體外41 ℃的條件下傳到150代(P150)作為疫苗免疫牛，能夠?qū)εＦ鸬胶芎玫拿庖弑Ｗo(hù)。此外，在我國(guó)還可在一定程度上利用豬肺炎支原體的減毒活疫苗來預(yù)防牛支原體病[16]，但這種方法在世界其它地區(qū)還未被接受。綜上所述，牛支原體疫苗的成功研制還需要更多的努力。

在牛支原體具體的致病機(jī)制和免疫逃逸機(jī)制還未得到完全闡明的現(xiàn)狀下，牛支原體疫苗的成功研制離不開具體毒株的分離鑒定以及相關(guān)攻毒模型的建立。目前，牛支原體已經(jīng)廣泛分布于我國(guó)各地區(qū)，且牛支原體的成功分離報(bào)道已很常見，但相關(guān)的毒力驗(yàn)證，特別是牛體的毒力驗(yàn)證則極少。由于牛支原體是一種條件致病菌，且常與其它病原混合感染，如不進(jìn)行支原體分離株的毒力驗(yàn)證，則無法確定其在相關(guān)疾病中是否是主要病因，也無法為牛支原體疫苗的研制提供有效的數(shù)據(jù)。為此，本研究在通過形態(tài)學(xué)觀察、生化和分子生物學(xué)鑒定確定后，又將該牛支原體分離株接種犢牛，結(jié)果表明該分離株對(duì)犢牛具有較強(qiáng)的毒力。在考慮到動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)以及操作工作量后，本研究在采用與張瑞[17]等報(bào)道相同的攻毒劑量和攻毒途徑的基礎(chǔ)上只進(jìn)行了一次攻毒，就引起了犢牛明顯的臨床癥狀和病理變化，從而為牛支原體的毒力研究和攻毒模型的建立提供了重要的數(shù)據(jù)支持和生物材料。