孫 強宋維亮王俊偉程 康

(天津市第三中心醫(yī)院普外科,天津 300170)

結腸癌是一種高發(fā)性的消化道惡性腫瘤,該病主要發(fā)生在直腸與乙狀結腸交界位置[1]。在全球的惡性腫瘤中,發(fā)病率已上升到第三位,死亡率排名第一位,發(fā)病人群主要集中在 40 ～50 歲[2]。結腸癌的發(fā)生涉及到多種原癌基因和抑癌基因等多個階段,是多種癌基因相互作用的結果。當原癌基因和抑癌基因的平衡被打破,原癌基因過度表達,而抑癌基因失去活性時,免疫機制無法控制癌細胞的發(fā)展而形成癌變[3]。miRNAs 可以通過直接靶向mRNAs 來調節(jié)基因的表達,導致其翻譯抑制或不穩(wěn)定性。miR-377 是miRNAs 家族中的重要成員,在多種腫瘤中起著重要的作用。miR-377-5p 屬于miR-377 的成熟體,相關研究報道,miR-377-5p 可能具有抑制肝細胞癌的作用,可以降低HepG2 細胞的增殖水平和侵襲能力,進而抑制血管內皮細胞生長因子通路的激活[4]。但miR-377-5p 在結腸癌生長發(fā)育中的確切作用尚不清楚。在腫瘤生長過程中,VEGFs 是淋巴管生成和血管生成的關鍵調節(jié)因子,VEGFs 及其受體(VEGFRs)也是淋巴管生成和血管生成信號的病理治療的主要靶點[5]。VEGF-A 主要調控血管生成,而VEGF-C 調節(jié)血管生成和淋巴管生成,VEGF-C 是一種很有前途的調控腫瘤轉移和發(fā)展的靶點[6],但在結腸癌中的作用和機制尚不清楚。因此,本研究探討miR-377-5p 通過下調VEGFC 對結腸癌的血管和淋巴管生成的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

結腸癌細胞株SW620 和人臍靜脈內皮細胞HUVECs(中國典型培養(yǎng)物保藏中心);收集2018年5 月到2019 年12 月行手術切除的結腸癌組織標本49 例,所有患者的病例資料完整,術中標本迅速切取癌組織和正常組織,正常組織距離腫瘤邊緣10 cm。所有標本放于液態(tài)氮中,快速轉入實驗室,-80℃的冰箱中保存?；颊咝g后病理診斷為原發(fā)性結腸癌患者,術前未經過化療和放療等治療,本研究通過天津市第三中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準(20200116),經過患者知情確認。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640 和胎牛血清(長沙艾佳生物技術有限公司);TRIzol 試劑(上海吉凱生物公司);反轉錄試劑盒、RIPA 裂解液、磷酸鹽緩沖液(江蘇碧云天生物科技研究所);DAB 試劑盒、胎牛血清、羊抗兔二抗(浙江天杭生物科技股份有限公司);離心機(德國Sigma 公司);高速冷凍離心機(日本日立公司);JY200C 電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司)L-420低速離心機(湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和轉染

結腸癌細胞株SW620 放于添加100 U/mL 的青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng),條件為37℃,含5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞處于對數(shù)生長期時用胰酶消化后進行實驗。該實驗分為3 組,miR-377-5p 干擾組、miR-377-5p 陰性對照組和 miR-377-5p 過表達組。miR-377-5p 干擾組轉染miR-377-5p siRNA 干擾表達病毒載體和脂質體,miR-377-5p 陰性對照組加入脂質體,miR-377-5p 過表達組轉染miR-377-5p 病毒載體和脂質體,轉染成功后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,進行后續(xù)實驗檢測。

1.3.2 實時熒光 RT-PCR 檢測 miR-377-5p mRNA的表達

處理各組的結腸癌細胞株SW620 持續(xù)48 h后,進行收集,采用TRIzol 法從細胞中提取總RNA,利用反轉錄試劑盒從上述RNA 逆轉錄cDNA,最后利用miR-377-5p 引物和GAPDH 引物在應用生物系統(tǒng)7500 實時PCR 系統(tǒng)上進行了實時qPCR,反應條件90℃ 預變性 6 min;85℃變性 30 s,50℃ 退火15 s,45℃ 延伸20 s,共設置50 個循環(huán)。PDL1 引物序列為:5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′(上游)和 5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′ ( 下 游 )。GAPDH 引物序列為:5′-TCCAGCTGGGUCACACU-3′(上游) 和 5′-GTCGGCAATTCAGTTGAGTTG-3′(下游)。

1.3.3 Western blot 檢測miR-377-5p 的蛋白表達

處理各組的結腸癌細胞株SW620 持續(xù)48 h后,進行收集,通過加入RIPA 裂解緩沖液進行裂解,用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,然后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF 膜被特定的初級抗體孵育miR-377-5p、VEGF-A、VEGF-C、 P-Akt、VEGFR-3 和GADPH 在4°C,在放入5%脫脂牛奶在室溫下孵育1.5 h。24 h 后的孵化一抗,使用 PBS 膜清洗 3 次,二抗孵育 miR-377-5p、VEGF-A、VEGF-C、 P-Akt、VEGFR-3 和 GADPH 室溫 2 h,用 BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。

1.3.4 CCK-8 法檢測細胞增殖

取各組對數(shù)生長期的結腸癌細胞株SW620 接種在 96 孔板中,在 24 h、48 h、72 h 替換原培養(yǎng)基一次,加入CCK-8 溶液之前以每孔200 μL 不含藥物的無血清培養(yǎng)基取代原培養(yǎng)液,再加入濃度為5 g/L的 CCK-8 溶液 20 μL,孵育 4 h。酶標儀參數(shù)設置為450 nm,檢測各孔的光密度值。

1.3.5 流式細胞法檢測細胞凋亡

取各組對數(shù)生長期的結腸癌細胞株SW620,用胰酶消化,接種于6 孔培養(yǎng)板中,放在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h 后收集細胞,調整細胞濃度,PBS 洗滌,離心處理,4℃,2000 r/min 離心 20 min,棄上清。加入 5 μL Annexin V-FITC,搖勻,避光孵育10 min,1 h 后檢查細胞的凋亡率。應用計算機WinMDI 軟件分析,得出細胞的凋亡情況。

1.3.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移

取各組對數(shù)生長期的結腸癌細胞株SW620 接種6 孔板中,用200 μL 黃槍頭的槍尖在6 孔板中間位置,劃出一條貫穿培養(yǎng)孔的劃痕,需要各孔的劃痕一致,去培養(yǎng)液,PBS 漂洗3 次,在培養(yǎng)48 h,棄懸浮細胞,對各孔進行拍照,觀察劃痕附近的細胞遷移情況。

1.3.7 Transwell 法檢測細胞侵襲

將transwell 小室取出,棄液體,PBS 漂洗5 min,再用4%多聚甲醛固定15 min,在胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h,將 100 μL 細胞 (1×105/mL) 的接種24 孔板中,然后放入600 μL 含有20%FBS 的RPMI-1640,在37℃的 濃度為5%的 CO2培養(yǎng)箱中孵育,用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞或未侵襲的細胞,遷移的細胞或入侵細胞用70%甲醛溶液固定30 min, 并使用0.1%的結晶紫染色20 min,使用顯微鏡捕獲每個孔中遷移或侵襲的細胞的圖像。

1.3.8 血管生成實驗檢測血管和淋巴管生成

通過血管生成實驗檢測HUVECs 在基質凝膠上形成毛細血管的能力,轉染的HUVECs 克隆細胞放入0.2%的BSA 補充的內皮基培養(yǎng)基中孵育24 h。隨后,收集 8×104HUVECs,接種 12 孔基底膜基質水凝膠基質板上。孵育8 h 后,用顯微鏡觀察血管生成。用Leica LAS 軟件在10 個隨機選擇的視場(放大倍率×100)中拍攝毛細血管的形態(tài)學圖像,并在3 個攝影視場中計數(shù)毛細血管。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 對計數(shù)資料進行統(tǒng)計分析,結果以平均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間采用單因素方差分析,組間的兩兩比較采用t檢驗,組間多重比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-377-5p 在結腸癌組織中的表達

與正常結腸組織對比,結腸癌組織中miR-377-5p mRNA 和miR-377-5p 蛋白的表達明顯低于正常結腸組織,差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表1,圖1)。

2.2 組間miR-377-5p mRNA 及蛋白的表達

與miR-377-5p 干擾組相比,miR-377-5p 陰性對照組和miR-377-5p 過表達組中的mRNA 及蛋白顯著升高(均P<0.05),與miR-377-5p 陰性對照組相比,miR-377-5p 過表達組的mRNA 及蛋白明顯增加(P<0.05)(表2,圖2)。

2.3 過表達miR-377-5p 對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響

與miR-377-5p 干擾組相比,miR-377-5p 陰性對照組和miR-377-5p 過表達組的結腸癌細胞增殖能力明顯降低(P<0.05),與miR-377-5p 陰性對照組相比,miR-377-5p 過表達組的結腸癌細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)(圖3A);與miR-377-5p 干擾組相比,miR-377-5p 陰性對照組和miR-377-5p 過表達組的結腸癌細胞增殖凋亡明顯升高(P<0.05),與miR-377-5p 陰性對照組相比,miR-377-5p 過表達組的結腸癌細胞凋亡能力顯著升高(P<0.05)(圖3B)。

圖1 結腸癌組織和正常結腸組織中miR-377-5p蛋白的表達Figure 1 Expression of miR-377-5p in colon cancer and normal colon

2.4 過表達miR-377-5p 對結腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響

與miR-377-5p 干擾組和miR-377-5p 陰性對照組相比,miR-377-5p 過表達組的結腸癌細胞的遷移能力和侵襲能力顯著降低(P<0.05)(圖4A、4B)。

2.5 過表達miR-377-5p 對VEGF-C 和巴管生成的影響

與miR-377-5p 干擾組和miR-377-5p 陰性對照組相比,miR-377-5p 過表達組的 VEGF-A、VEGF-C和P-Akt、VEGFR-3 蛋白水平顯著低降低(P<0.05)(圖5)。

表1 結腸癌組織和正常結腸組織中miR-377-5p mRNA 及蛋白的表達(±s)Table 1 Expression of mir-377-5p mRNA and protein in colon cancer and normal colon

表1 結腸癌組織和正常結腸組織中miR-377-5p mRNA 及蛋白的表達(±s)Table 1 Expression of mir-377-5p mRNA and protein in colon cancer and normal colon

注: 與正常結腸組織相比,?P<0.05。Note.Compared with normal colon tissue,aP<0.05.

分組Groups例數(shù)Number of cases miR-377-5p mRNA miR-377-5p 蛋白miR-377-5p protein正常結腸組織Normal colon tissue 50 3.31±0.28 3.69±0.44結腸癌組織Colon cancer tissue 56 0.98±0.07? 1.36±0.19?

表2 組間miR-377-5p mRNA 及蛋白的表達(±s)Table 2 Expression of mir-377-5p mRNA and protein between groups

表2 組間miR-377-5p mRNA 及蛋白的表達(±s)Table 2 Expression of mir-377-5p mRNA and protein between groups

注: 與miR-377-5p 干擾組相比,?P<0.05;與 miR-377-5p 陰性對照組相比,#P<0.05。Note.Compared with normal colon tissue,a P<0.05,Compared with mir-377-5p negative control group, #P<0.05.

分組Groups miR-377-5p mRNA miR-377-5p 蛋白miR-377-5p protein miR-377-5p 干擾組miR-377-5p interference group 0.43±0.05 0.52±0.12 miR-377-5p 陰性對照組miR-377-5p negative control group 1.00±0.03? 1.29±0.37?miR-377-5p 過表達組miR-377-5p overexpression group 23.57±8.69?# 25.78±10.38?#

圖2 組間miR-377-5p 蛋白的表達Figure 2 Expression of miR-377-5p protein between groups

2.6 過表達miR-377-5p 對血管和淋巴管生成的影響

與miR-377-5p 干擾組和miR-377-5p 陰性對照組相比,miR-377-5p 過表達組的 MVD(微血管密度)和 LMVD(淋巴微血管密度)顯著降低(P<0.05)(圖6)。

圖3 miR-377-5p 過表達對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響Figure 3 Effect of miR-377-5p overexpression on proliferation and apoptosis of colon cancer cells

圖4 miR-377-5p 過表達對結腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響Figure 4 Effect of miR-377-5p overexpression on colon cancer cell migration and invasion ability

圖5 miR-377-5p 過表達對血管內皮生長因子VEGF-C 的影響Figure 5 Effect of miR-377-5p overexpression on vascular endothelial growth factor VEGF-C

3 討論

結腸癌的發(fā)生涉及到多基因和多步驟的復雜過程,大約35%的結腸癌患者與遺傳易感性有關[7]。miRNA 通過抑制翻譯和誘導mRNA 降解達到抑制靶基因的作用,到目前為止,在人類基因組織中已經發(fā)現(xiàn)700 多種miRNAs,miRNA 又能調控30%以上的人類靶基因[8]。多項研究結果表明,miRNA 是調節(jié)腫瘤的發(fā)生和惡性進展的關鍵基因和信號通路表達,從而調節(jié)腫瘤的表型[9]。miRNA可以調控腫瘤的生長、增殖、遷移和侵襲,在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究結果表明,與正常結腸組織對比,結腸癌組織中miR-377-5p mRNA 和miR-377-5p 蛋白的表達明顯低于正常結腸組織;與miR-377-5p 干擾組相比,miR-377-5p 陰性對照組和miR-377-5p 過表達組中的mRNA 及蛋白顯著升高,與miR-377-5p 陰性對照組相比,miR-377-5p 過表達組的mRNA 及蛋白明顯增加。從而說明miR-377-5p 可能是一種有效的結腸癌生物標志物。相關研究表明,miR-377-5p參與調控胃癌細胞的增值和凋亡,在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[10]。為了表明miR-377-5p 的作用,本研究在分析中發(fā)現(xiàn)miR-377-5p 能夠明顯抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,同時也促進細胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-377-5p 可以抑制結腸癌的發(fā)生,可被視為結腸癌的重要診斷生物標志物和有用的治療靶點。然而,miR-377-5p 的活性也可能影響腫瘤中的其他細胞,如內皮細胞,這需要進一步研究。

圖6 miR-377-5p 過表達對血管和淋巴管生成的影響Figure 6 Effect of miR-377-5p overexpression on angiogenesis and lymphangiogenesis

最近的研究表明,miRNAs 參與不同方面的血管生成的調節(jié)[11]。實質上我們對miRNAs 在結腸癌血管生成和淋巴管生成中的作用知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn),在結腸癌細胞中,VEGF-C 通過miR-377-5p 與其mRNA 3′-UTR 的結合而發(fā)生轉錄后逆轉錄調控。此外,在結腸癌細胞中過表達miR-377-5p 可降低腫瘤血管生成和淋巴管生成的關鍵調控因子VEGF-C、VEGF-A 和 VEGFR-3 的表達,從而降低 p-AKT 的磷酸化水平,抑制了血管生成和淋巴管生成。這些發(fā)現(xiàn)表明,miR-377-5p 可能通過直接靶向與淋巴管生成和血管生成相關的因子VEGF-C 抑制結腸癌的生長。

在很多病理和生理的過程中,比如血管和淋巴管生成,血管和淋巴管通透性的改變,VEGF 的家族都發(fā)揮著不可或缺的重要作用[12]。在這些生長因子中VEGF-C 在腫瘤血管和淋巴管生成過程中發(fā)揮著主要作用,是近年來發(fā)現(xiàn)的VEGF 家族新成員,也是VEGF 的重要成員[13]。VEGF-C 在腫瘤和內皮細胞中都有表達[14]。血管內皮生長因子3(VEGFR-3)是淋巴內皮細胞特異性標記物,屬于VEGF-C 的特異性受體,在腫瘤的淋巴管生成中起著重要作用[15]。在各種惡性腫瘤中,過表達 VEGF-C 以及VEGFR-3 都與不良的預后具有明顯的相關性[16]。VEGF-A 調節(jié)活性最強,促進新生血管的生成,為機體提供所需的氧。在本研究中發(fā)現(xiàn),miR-377-5p 過表達組的 VEGF-A、VEGF-C、 VEGFR-3 蛋白水平顯著低于miR-377-5p 干擾組和miR-377-5p 陰性對照組,且miR-377-5p 過表達組的 MVD 和 LMVD 顯著低于miR-377-5p 干擾組和miR-377-5p 陰性對照組。相關研究表明,在血管新生過程中,VEGF-A、VEGFC、VEGFR-3 誘導內皮細胞向促血管發(fā)生因子移動和增殖[17]。也有研究表明,在成鼠的淋巴管再生模型中再次證實了VEGF-C 和VEGFR-3 信號通路在淋巴管萌發(fā)過程中的重要性[18]。

本研究結果證實的關鍵功能是miR-377-5p 在調節(jié)VEGF-C 和VEGF-A 表達上奠定了一定基礎,開發(fā)新的治療結腸癌的方法, 特別是針對腫瘤血管和淋巴管生成方面。大量研究表明miRNA 能夠調節(jié)幾個致癌基因[19],所以miRNA 的表達在腫瘤治療中具有巨大的潛力。因此,本研究關于結腸癌的數(shù)據(jù)清楚的表明,過表達miR-377-5p 在結腸癌治療中可能具有很高的價值。

綜合上述,miR-377-5p 在結腸癌中低表達,抑制了結腸癌細胞的增殖、細胞遷移和侵襲,促進了結腸癌細胞的凋亡能力,并通過直接靶向VEGF-C抑制腫瘤的血管和淋巴管生成。但在miR-377-5p表達可阻斷腫瘤進展以及p-AKT 信號通路的作用機制方面有待進一步研究。