阮慶芬楊德祥楊理偉?

(1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科, 云南大理 671000; 2.大理州人民醫(yī)院麻醉科, 云南 大理 671000)

胃癌是臨床上常見的惡性腫瘤,其發(fā)展速度極快,嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量[1]。胃癌作為一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其分子發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜,基因異常表達(dá)是胃癌發(fā)生的重要原因[2]。miRNA 是在人體組織中廣泛表達(dá)的非編碼RNA,其具有多種生物學(xué)功能,在人體正常生命進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。研究顯示,miRNA 不僅參與正常生理過程,還與疾病的發(fā)生關(guān)系密切,miRNA 在疾病中異常表達(dá)往往與疾病的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[4]。很多研究發(fā)現(xiàn),miRNA在腫瘤中的表達(dá)改變與腫瘤患者的臨床病理特征有關(guān),miRNA 還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長和凋亡[5]。miR-572 是近些年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的miRNA,miR-572 在卵巢癌等腫瘤中高表達(dá),具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用,miR-572 在腫瘤中可能發(fā)揮類似癌基因的作用[6]。以前的研究顯示,miR-572在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著升高,miR-572 可能參與胃癌進(jìn)展[7]。含 WW 域的氧化還原酶(WW Domain-containing Oxidoreductase,WWOX)是一個在胃癌中表達(dá)下調(diào)的調(diào)控基因,上調(diào)其表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[8]。我們前期的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)miR-572與WWOX可能互為靶向關(guān)系。本次實驗旨在體外探討miR-572 對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗細(xì)胞

胃癌細(xì)胞 HGC-27、AGS、NCI-N87 購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

Lipofectamin 2000 ( 11668027 ) 購自美國invitrogen; B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病- 2 (B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)抗體(PAB16882)購自艾美捷科技有限公司;正常胃黏膜細(xì)胞GES-1 購自上海艾研生物科技有限公司;細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶 4 (cyclin-dependent kinase 4, CDK4) 抗體(XY11026-1)、p21 抗體(xy-3316R)購自上海信裕生物工程有限公司;miScript Reverse Transcription Kit ( 218160)、 miScript SYBR Green PCR Kit(218073)購自德國Qiagen;Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)抗體(GD-H1122)購自上海古朵生物科技有限公司; miR-572 inhibitor、inhibitor control 由吉滿生物科技(上海)有限公司構(gòu)建合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 Real-time PCR 方法測定miR-572 在胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜細(xì)胞中的表達(dá)水平

收集對數(shù)期的胃癌細(xì)胞HGC-27、AGS、NCI-N87和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1,用TRIzol 提取總RNA,RNA 溶解在 DEPC 水中,然后放在-80℃保存。用miScript Reverse Transcription Kit 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反 轉(zhuǎn) 錄 體 系 為: 1 μL 的 miScript Reverse Transcription Mix、4 μL 的 5×miScript RT Buffer、5 μL的 Total RNA,加 RNase-free Water 補(bǔ)足至 20 μL。cDNA 保存在-20℃。用 miScript SYBR Green PCR Kit 進(jìn)行 PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系為:2 μL 的 10 ×miScript primer Assay、 2 μL 的 miScript Universal Primer、10 μL 的 2× Quantitect SYBR Green PCR Master mix、2 μL 的 Template cDNA,加 RNase-free Water 補(bǔ)足至 20 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95℃ 孵育15 min,95℃變性15 s,55℃條件下退火30 s,70℃條件下延伸 30 s,一共 40 個循環(huán)。用 2-△△Ct方法獲得目的基因的相對表達(dá)水平。U6 為內(nèi)參。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組處理

取生長狀態(tài)良好的胃癌細(xì)胞NCI-N87,接種到6孔板,接種密度為每孔2×105個,觀察細(xì)胞密度為70%,進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟完全按照Lipofectamin 2000 說明書進(jìn)行,培養(yǎng)48 h 以后,用于后續(xù)實驗。把轉(zhuǎn)染 inhibitor control 和 miR-572 inhibitor 的胃癌細(xì)胞 NCI-N87 命名為 Anti-NC 和Anti-miR-572。把沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為Control。

1.3.3 MTT 方法測定下調(diào)miR-572 對細(xì)胞增殖影響

Control、Anti-NC、Anti-miR-572 組細(xì)胞以每孔5000 個細(xì)胞分別接種到96 孔板內(nèi),然后放在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板,在每個孔中分別加入MTT 溶液各20 μL,繼續(xù)在37℃孵育 4 h。將培養(yǎng)板中的上清液棄掉,然后分別加入DMSO 溶液各150 μL,震蕩反應(yīng)10 min。將酶標(biāo)儀波長調(diào)整為490 nm,檢測每個孔的A 值。

1.3.4 PI 單染法測定下調(diào)miR-572 對細(xì)胞周期分布影響

取生長狀態(tài)良好的 Control、Anti-NC、Anti-miR-572 組細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶將細(xì)胞消化,配制成單細(xì)胞懸浮液,以冰預(yù)冷后的不含鈣鎂離子的PBS 溶液將細(xì)胞洗滌3 次。最后將細(xì)胞重新懸浮于PBS 溶液中。添加-20℃預(yù)冷的75%的乙醇溶液,放在4℃過夜反應(yīng)。1062 r/min 離心10 min,吸棄上清。添加PI 染色液,置于4℃條件下避光反應(yīng)20 min。以 488 nm 的激發(fā)波長、600 nm 的波長濾器用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI 雙染法測定下調(diào)miR-572 對細(xì)胞凋亡影響

取生長狀態(tài)良好的 Control、Anti-NC、Anti-miR-572 組細(xì)胞,以 PBS 溶液洗滌,然后收集 5×105個細(xì)胞,添加 400 μL 的 Binding Buffer 將細(xì)胞懸浮,加入5 μL 的 Annexin V-FITC 至細(xì)胞懸浮液中,混合均勻,然后放在4℃條件下避光反應(yīng)15 min。加入PI染色液,繼續(xù)在4℃條件下反應(yīng)10 min。用流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。

1.3.6 Western blot 方法測定下調(diào)miR-572 對細(xì)胞中 CDK4、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)影響

取生長狀態(tài)良好的 Control、Anti-NC、Anti-miR-572 組細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,以BCA 蛋白定量測定試劑盒檢測蛋白濃度。本次實驗選用5%的濃縮膠和8%的分離膠進(jìn)行電泳。蛋白樣品中添加5×Loading Buffer 混合后,放在沸水浴中煮沸5 min。每個孔中添加40 μg 蛋白樣品,濃縮膠中用80 V 電壓電泳,分離膠中用120 V 電壓電泳,用溴酚藍(lán)作為指示劑,指示劑進(jìn)入到凝膠的底部以后,停止電泳。將PVDF 膜剪成與分離膠大小一致,以甲醇預(yù)處理30 s,然后置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡30 min,以100 V電壓轉(zhuǎn)膜1 h。然后將PVDF 膜浸泡在5%脫脂奶粉溶液中孵育2 h。取出PVDF 膜,置于一抗、二抗反應(yīng)液中充分結(jié)合,ECL 顯色,用Image Quant version分析條帶的A 值,以GAPDH 作為內(nèi)參,分析目的蛋白表達(dá)變化。

1.3.7 miR-572 靶基因預(yù)測和鑒定

Targetscan 在線靶基因預(yù)測軟件分析miR-572的靶基因,發(fā)現(xiàn)WWOX的 3′UTR 端與 miR-572 有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。利用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定靶向關(guān)系,構(gòu)建含有WWOX的3′UTR 結(jié)合位點(diǎn)的野生型(MUT)熒光素酶報告載體和不含WWOX的3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的突變型(WT)熒光素酶報告載體,熒光素酶報告載體由南京科佰生物科技有限公司構(gòu)建。將 MUT 和 WT 分別與 miR-572 inhibitor 和 inhibitor control 共轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞NCI-N87 中,培養(yǎng)48 h 以后,用熒光素酶活性測定試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3.8WWOXsiRNA 對下調(diào)miR-572 的細(xì)胞增殖、周期和凋亡逆轉(zhuǎn)作用檢測

在胃癌細(xì)胞NCI-N87 中分別共轉(zhuǎn)染 miR-572 inhibitor、siRNA control 和 miR-572 inhibitor、WWOXsiRNA,并命名為 Anti-miR-572+si-NC、Anti-miR-572+si-WWOX,按照上述方法分別測定細(xì)胞增殖、周期、凋亡和 CDK4、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析,數(shù)據(jù)按照平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗,多組差異比較用單因素方差,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-572 在胃癌細(xì)胞和胃黏膜細(xì)胞中的表達(dá)差異

結(jié)果見表1, 胃癌細(xì)胞HGC-27、AGS、NCI-N87 中miR-572 表達(dá)水平高于正常胃黏膜細(xì)胞GES-1(P<05)。胃癌細(xì)胞 HGC-27、AGS 中 miR-572 表達(dá)水平低于胃癌細(xì)胞NCI-N87(P<05)。miR-572 在胃癌細(xì)胞中高表達(dá),選用胃癌細(xì)胞NCI-N87 做后續(xù)實驗。

2.2 miR-572 inhibitor 下調(diào)效果

結(jié)果見表2,胃癌細(xì)胞NCI-N87 轉(zhuǎn)染miR-572 inhibitor 后,細(xì)胞中 miR-572 表達(dá)水平下降(P<0.05)。miR-572 inhibitor 下調(diào)胃癌細(xì)胞 NCI-N87 中miR-572 表達(dá)水平。

2.3 下調(diào)miR-572 對胃癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡影響

結(jié)果見圖1 和表3,胃癌細(xì)胞NCI-N87 轉(zhuǎn)染miR-572 inhibitor 后,細(xì)胞A 值降低,G1 期細(xì)胞比例升高,細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞中CDK4、Bcl-2 蛋白表達(dá)減少,p21、Bax 蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。下調(diào) miR-572 抑制胃癌細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表1 胃癌細(xì)胞 HGC-27、AGS、NCI-N87 和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1 中miR-572 表達(dá)水平( ±s)Table 1 Expression levels of mir-572 in hgc-27,AGS, NCI-N87 and GES-1 cells

表1 胃癌細(xì)胞 HGC-27、AGS、NCI-N87 和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1 中miR-572 表達(dá)水平( ±s)Table 1 Expression levels of mir-572 in hgc-27,AGS, NCI-N87 and GES-1 cells

注: 與 GES-1 細(xì)胞相比,? P<0.05; 與 HGC-27 和 AGS 細(xì)胞相比,&P<0.05。Note.Compared with GES-1 cells, ?P<0.05.Compared with HGC-27 and AGS cells, &P<0.05.

細(xì)胞Cells miR-572 水平miR-572 level GES-1 1.00±0.10 HGC-27 1.98±0.15?AGS 2.47±0.31?NCI-N87 2.84±0.26?&F 116.60 P<0.001

2.4 miR-572 和 WWOX 靶向關(guān)系鑒定

結(jié)果見圖2 和表4,在線靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)WWOX的3,UTR 端與 miR-572 有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),并且 WT 和 miR-572 inhibitor 共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性升高。miR-572 和WWOX互為靶向關(guān)系。

表2 miR-572 inhibitor 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞NCI-N87 中miR-572 表達(dá)水平( _x ± s)Table 2 Expression levels of mir-572 in NCI-N87 cells transfected with miR-572 inhibitor

注:A:流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡;B:Western blot 方法檢測CDK4、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)。圖1 下調(diào) miR-572 對胃癌細(xì)胞 NCI-N87 凋亡以及 CDK4、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)影響Note.A, Flow cytometry determination of cell apoptosis in each group.B, Western blot determination of CDK4, p21, Bcl-2, Bax, WWOX protein expression in each group of cells.Figure 1 Down regulation of mir-572 induces apoptosis and expression of CDK4, p21, Bcl-2 and Bax proteins in gastric cancer cell line NCI-N87

表3 miR-572 inhibitor 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞 NCI-N87 的 A 值、周期分布、凋亡率和 CDK4、p21、Bcl-2、Bax 蛋白水平( _x ± s)Table 3 A value, cycle distribution, apoptosis rate and CDK4, p21, Bcl-2, Bax protein levels (meansd) of NCI-N87 cells transfected with miR-572 inhibitor

圖2 WWOX 的 3′UTR 端與 miR-572 互補(bǔ)位點(diǎn)示意圖Figure 2 Schematic diagram of 3′UTR and miR-572 complementary sites of WWOX

2.5 下調(diào)miR-572 對胃癌細(xì)胞中WWOX 蛋白表達(dá)影響

結(jié)果見圖3 和表5,胃癌細(xì)胞 NCI-N87 轉(zhuǎn)染miR-572 inhibitor 后,細(xì)胞中WWOX 蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。下調(diào) miR-572 促進(jìn)胃癌細(xì)胞中WWOX 蛋白表達(dá)。

2.6 WWOX siRNA 對下調(diào)miR-572 影響胃癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的作用

結(jié)果見圖4 和表6,與共轉(zhuǎn)染miR-572 inhibitor、siRNA control 的細(xì)胞比較,共轉(zhuǎn)染miR-572 inhibitor、WWOXsiRNA 后的胃癌細(xì)胞NCI-N87 的A 值升高,G1 期細(xì)胞比例降低,凋亡率也下降,細(xì)胞中CDK4、Bcl-2 蛋白表達(dá)增多,p21、Bax、WWOX 蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。WWOXsiRNA 逆轉(zhuǎn)下調(diào) miR-572 對胃癌細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)作用。

3 討論

本次實驗表明,miR-572 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞,并且下調(diào)miR-572可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。miR-572 是一個在人體內(nèi)廣泛表達(dá)的miRNA,其參與老年癡呆、神經(jīng)發(fā)育等過程[9]。miR-572 還與腫瘤有關(guān),miR-572 在卵巢癌中表達(dá)上調(diào),下調(diào)其表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞惡性增殖[6]。在胃癌組織中的研究顯示,miR-572 在胃癌患者中高表達(dá),并且與胃癌患者的病理分期有關(guān)[7]。我們的實驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相符合,說明miR-572 在胃癌中高表達(dá),下調(diào)miR-572 可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長,這為研究miR-572 在胃癌進(jìn)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

胃癌細(xì)胞惡性增殖與細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān),細(xì)胞周期是生命進(jìn)程中的基本生理過程,其是指上一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束,包括DNA 的合成以及細(xì)胞分裂兩個主要部分[10]。細(xì)胞周期有序進(jìn)展受到一系列基因的調(diào)控作用,細(xì)胞周期調(diào)控因子有很多,其中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶是最為重要的調(diào)控蛋白,CDK4 是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的成員之一,其在G1 期發(fā)揮重要作用,能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[11-13]。CKI 基因是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子,P21 是一種CKI 基因,可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的生物學(xué)作用,其在細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用[14-15]。Bax 和Bcl-2 均屬于Bcl-2 蛋白家族成員,在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,Bax 是細(xì)胞凋亡的促進(jìn)因子,Bcl-2是細(xì)胞凋亡的抑制因子[16-17]。本次實驗表明,下調(diào)miR-572 后的胃癌細(xì)胞G1 期細(xì)胞比例升高,細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞中 CDK4、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平下降,p21、Bax 蛋白表達(dá)水平升高,提示下調(diào) miR-572 阻滯胃癌細(xì)胞周期進(jìn)展并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

表4 WT 和MUT 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞NCI-N87熒光素酶活性( ±s)Table 4 luciferase activity of NCI-N87 gastric cancer cells transfected with WT and MUT

表4 WT 和MUT 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞NCI-N87熒光素酶活性( ±s)Table 4 luciferase activity of NCI-N87 gastric cancer cells transfected with WT and MUT

注: 與 Anti-NC 相比,?P<0.05。Note.Compared with Anti-NC, ?P<0.05.

組別Groups MUT WT Anti-NC 1.00±0.12 1.00±0.10 Anti-miR-572 1.01±0.13 2.75±0.26?t 0.17 18.85 P 0.87 <0.001

圖3 Western blot 方法測定下調(diào)miR-572 對胃癌細(xì)胞NCI-N87 中WWOX 蛋白表達(dá)影響Figure 3 Expression of WWOX protein in gastric cancer cell line NCI-N87 was determined by Western blot

表5 miR-572 inhibitor 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞NCI-N87 中WWOX蛋白水平( ±s)Table 5 WWOX protein levels in gastric cancer cells NCI-N87 after miR-572 inhibitor transfection

表5 miR-572 inhibitor 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞NCI-N87 中WWOX蛋白水平( ±s)Table 5 WWOX protein levels in gastric cancer cells NCI-N87 after miR-572 inhibitor transfection

注: 與 Anti-NC 相比,?P<0.05。Note.Compared with Anti-NC, ?P<0.05.

組別Groups WWOX Control 0.39±0.07 Anti-NC 0.40±0.05 Anti-miR-572 0.65±0.06?F 53.26 P<0.001

注:A:流式細(xì)胞術(shù)測定各組細(xì)胞凋亡情況;B:Western blot 測定各組細(xì)胞中CDK4、p21、Bcl-2、Bax、WWOX 蛋白表達(dá)。圖4 WWOX siRNA 對下調(diào) miR-572 的胃癌細(xì)胞凋亡和 CDK4、p21、Bcl-2、Bax、WWOX 蛋白表達(dá)影響Note.A, Flow cytometry determination of cell apoptosis in each group.B, Western blot determination of CDK4, p21, Bcl-2, Bax, WWOX protein expression in each group of cells.Figure 4 Effect of WWOX siRNA on down-regulation of miR-572 gastric cancer cell apoptosis and the expression of CDK4, p21, Bcl-2, Bax and WWOX protein

表6 WWOX siRNA 和miR-572 inhibitor 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞NCI-N87 的A 值、周期分布、凋亡率和 CDK4、p21、Bcl-2、Bax、WWOX 蛋白水平( _x ± s)Table 6 A value, cycle distribution, apoptosis rate and CDK4, p21, Bcl-2, Bax, WWOX protein levels of gastric cancer cells NCI-N87 after transfection with WWOX siRNA and miR-572 inhibitor

我們的實驗還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-572 可以靶向負(fù)調(diào)控胃癌細(xì)胞中的WWOX基因。WWOX是在染色體普通脆性位點(diǎn)克隆得到的一個新基因,其編碼的蛋白質(zhì)由414 個氨基酸組成,WWOX 蛋白有兩個WW 結(jié)構(gòu)域和一個短鏈脫氫還原酶,參與肺間質(zhì)纖維化等過程[18-20]。WWOX在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用,其是目前發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[21-22]。WWOX在胃癌組織中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)WWOX可以抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[23]。本次實驗證實,下調(diào)WWOX可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-572 對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的作用,提示miR-572 作用機(jī)制與WWOX有關(guān)。

總而言之,miR-572 在胃癌細(xì)胞中高表達(dá),下調(diào)miR-572 可以抑制胃癌細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制與靶向調(diào)控WWOX有關(guān)。以后會在多株胃癌細(xì)胞以及體內(nèi)驗證miR-572 的作用機(jī)制。本實驗結(jié)果為研究miR-572 在胃癌進(jìn)展中的作用提供了參考,為靶向治療胃癌提供了新方向。