張 潔，楊 譚，盧永剛

（廣西壯族自治區(qū)柳州市柳鐵中心醫(yī)院藥劑科，廣西柳州545007）

癌癥是臨床上常見的惡性腫瘤，進(jìn)展快、死亡率高，給患者身心及經(jīng)濟(jì)上帶來(lái)了巨大損害。腫瘤分子靶向藥物的出現(xiàn)將癌癥的治療推向了一個(gè)前所未有的階段。使用腫瘤分子靶向藥物治療腫瘤面臨的最主要問(wèn)題就是耐藥，一些分子靶向藥物可能同時(shí)具有多種耐藥機(jī)制。靶向藥物耐藥的主要機(jī)制包括微環(huán)境的改變、基因突變、建立代償信號(hào)通路、存在腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤對(duì)靶向藥產(chǎn)生耐受性等。近年來(lái)，高通量功能性篩選技術(shù)為腫瘤研究提供了精準(zhǔn)的基因?qū)W信息。而CRISPR?Cas9文庫(kù)篩選技術(shù)是一種精準(zhǔn)、簡(jiǎn)便、高效的基因編輯工具，為腫瘤相關(guān)耐藥基因的功能學(xué)研究提供了新方法、新思路［1］。本文總結(jié)了CRISPR?Cas9文庫(kù)篩選技術(shù)在腫瘤耐藥基因篩選中的研究進(jìn)展。

1 耐藥基因篩選的現(xiàn)狀

篩選耐藥基因當(dāng)前常用策略主要分為兩種，即功能缺失型篩選及功能獲得型篩選。RNA干擾（RNA interference，RNAi）在真核細(xì)胞中廣泛存在，已廣泛應(yīng)用于功能性缺失基因的高通量篩選［2］。與cDNA文庫(kù)相比，RNAi文庫(kù)篩選雖具有簡(jiǎn)單、高效、高通量的優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問(wèn)題［3］。無(wú)論是使用cDNA文庫(kù)還是RNAi文庫(kù)進(jìn)行耐藥基因篩選都不夠精準(zhǔn)。因此，尋找新的篩選工具對(duì)腫瘤耐藥基因的發(fā)現(xiàn)及研究有著重要的意義。

2 CRISPR?Cas9的生物學(xué)特性

CRISPR?Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中為了對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA進(jìn)化形成的一種適應(yīng)性免疫防御［4］。CRISPR?Cas于1987年被首次發(fā)現(xiàn)，其強(qiáng)大的剪切編輯功能在2010年被研究清楚，從而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究［5］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能識(shí)別出入侵者的原間隔序列并記錄到CRISPR序列中。當(dāng)剪切基因時(shí)，crRNA首先被轉(zhuǎn)錄成pre?crRNA。特異性RNA核酸酶和活化的cas9對(duì)pre?crRNA進(jìn)行加工［6］。CRISPR?Cas9系統(tǒng)通過(guò)與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)，引導(dǎo)Cas9定位于目標(biāo)基因，在PAM上游約3 bp處進(jìn)行DNA雙鏈切割［7］。當(dāng)沒有修復(fù)模板時(shí)，將通過(guò)非同源末端連接將DS?Bs重新連接，這樣容易產(chǎn)生插入或突變?nèi)笔?，?dǎo)致基因功能喪失［6］。

CRISPR?Cas9技術(shù)可以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的需要進(jìn)行更加精細(xì)的調(diào)整［7］。全基因組的CRISPR篩選幾乎可以應(yīng)用于任何細(xì)胞系和遺傳背景下的基因篩選，如KRAS、EGFR、ALK突變或其他人類腫瘤細(xì)胞系。其他遞送方法，如原位移植或靜脈注射，有助于鑒別那些參與腫瘤血管形成和外滲的過(guò)程［8］。

近年來(lái)，CRISP?Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于人類、小鼠、魚、果蠅、酵母、煙草、番茄、水稻、大豆、玉米、小麥等多個(gè)物種細(xì)胞的基因編輯，科學(xué)家們利用CRISPR?Cas9技術(shù)開始進(jìn)行功能性的基因篩選。CRISPR?Cas9技術(shù)在基因編輯中具有一定優(yōu)越性，可采用誘導(dǎo)基因突變方式進(jìn)行功能缺失型篩選，更加高效、精準(zhǔn)；敲除效率高，具有更廣泛的作用位點(diǎn)及較低的脫靶效率。CRISPR?Cas9基因敲除可用于大部分的基因修飾研究，而且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可以在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，將會(huì)在定向編輯研究中帶來(lái)突破性的發(fā)展［9］。

3 CRISPR?Cas9在腫瘤耐藥中的應(yīng)用

3.1 CRISPR?Cas9在肝癌耐藥中的應(yīng)用進(jìn)展

通過(guò)全基因組CRISPR?Cas9文庫(kù)篩選，研究者已經(jīng)篩選出在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的抑癌基因AD?AMTSL3、PTEN［10］，以 及 促 癌 基 因NSD1、NCAPG［11，12］，這 證 明 了CRISPR?Cas9文 庫(kù) 篩 選 在肝癌耐藥基因篩選中的可行性。索拉非尼是晚期肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，然而腫瘤細(xì)胞可表現(xiàn)出對(duì)索拉非尼的原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。Wei等［13］通過(guò)使用全基因組CRISPR?Cas9文庫(kù)篩選，發(fā)現(xiàn)磷酸甘油酸脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）是索拉非尼耐藥的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。索拉非尼治療后PHG?DH失活會(huì)升高活性氧（reactive oxygen species ROS）水平并誘導(dǎo)HCC凋亡。PHGDH抑制劑NCT?503的治療與索拉非尼有協(xié)同作用，可消除體內(nèi)HCC的生長(zhǎng)，因此，靶向PHGDH是克服HCC耐藥性的有效方法。使用同樣的方法，Cai等［14］在人類Huh7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LRP8是驅(qū)動(dòng)HCC細(xì)胞獲得索拉非尼耐藥的關(guān)鍵基因，LRP8通過(guò)激活β?catenin，增強(qiáng)了其對(duì)索拉非尼的耐藥性。Zheng等［15］通過(guò)基于模型的全基因組CRISP/Cas9敲除（MAGeCK）分析，KEAP1被確定索拉非尼耐藥性和/或HCC細(xì)胞敏感性相關(guān)的非突變機(jī)制的必需基因。KEAP1失活后，KEAP1/Nrf2通路的失控通過(guò)上調(diào)Nrf2下游基因和降低ROS水平導(dǎo)致治療HCC的索拉非尼、樂(lè)伐替尼和雷戈非尼耐藥。此外，通過(guò)該方法還篩選出對(duì)索拉非尼耐藥的關(guān)鍵基因SGOL1［16］。

3.2 CRISPR?Cas9在肺癌耐藥中的應(yīng)用進(jìn)展

化學(xué)療法作為單獨(dú)或與手術(shù)和放療結(jié)合使用的全身療法，旨在阻止癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。目前，癌細(xì)胞的耐藥性已成為影響化療療效的主要原因。編輯耐藥基因可提高化療療效和療效。目前，CRISPR?Cas9已被用于研究與肺癌藥物敏感性和耐藥性有關(guān)的基因，如順鉑、卡鉑和紫杉醇等，為提高化療對(duì)肺癌的治療效果提供了理論基礎(chǔ)。在H460和H1299細(xì)胞中，將RSF1基因與紫杉醇聯(lián)合敲除會(huì)導(dǎo)致G1的細(xì)胞周期停滯，同時(shí)抑制細(xì)胞遷移和增殖；在使用H 460細(xì)胞的異種移植小鼠肺癌模型中，與野生型相比，敲除RSF1顯著提高了對(duì)紫杉醇的敏感性，降低了移植腫瘤的重量（P<0.01）和體積（P<0.05）［17］。在另一項(xiàng)使用肺癌異種移植小鼠模型的研究中，CRIS?PR?Cas9在A 549細(xì)胞中敲除了NRF2基因，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型動(dòng)物，腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑和卡鉑敏感，移植瘤的體積明顯降低［18］。在NSCLC細(xì)胞系中，CRISPR?Cas9敲除極光B（AURKB）導(dǎo)致腫瘤的恢復(fù)，抑癌基因TP53的表達(dá)，恢復(fù)了對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性［19］。另一項(xiàng)研究表明，CRISPR?Cas9敲除ERCC1會(huì)使癌細(xì)胞對(duì)順鉑高度敏感［20］。肺癌對(duì)化療藥物耐藥性的研究為提高藥物敏感性和降低或消除肺癌對(duì)化療藥物的耐藥性提供了科學(xué)依據(jù)。

3.3 CRISPR?Cas9在乳腺癌耐藥中的進(jìn)展

雌激素受體（estrogen receptor，ER）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor recep?tor 2 HER2）突變?cè)谌橄侔┲委熌退幹凶饔藐P(guān)鍵，CRISPR?Cas9系統(tǒng)可用于靶向乳腺癌患者的ER或HER2突變體。sgRNA被設(shè)計(jì)為靶向ER或HER2突變外顯子中的特定序列，以修復(fù)突變，消除致癌突變。同時(shí)，CRISPR?Cas9還可以破壞ER或HER2的特定功能域，使癌細(xì)胞失去了獲得性耐藥性［21，22］。使 用CRISPR?Cas9技 術(shù) 使 得 兩 種 三 陰 性乳腺癌（triple?negative breast cancer，TNBC）細(xì)胞系MDA?MB?231（野生型）和MDA?MB?436（BRCA 1 m）產(chǎn)生缺陷，可使TNBC細(xì)胞對(duì)3種代表性的化學(xué)治療乳腺癌藥物阿霉素、吉西他濱和多西他賽更加敏感［23］。使用同樣的細(xì)胞系，使用CRISPR?Cas9進(jìn)行CXCR4或CXCR7基因的單敲除后，可顯著抑制TNBC細(xì)胞的惡性進(jìn)展，用于乳腺癌治療耐藥靶標(biāo)［24］?？傊?，CRISPR?Cas9系統(tǒng)可恢復(fù)耐藥基因突變并確定耐藥性乳腺癌的潛在耐藥靶標(biāo)。CRIS?PR?Cas9系統(tǒng)有望在預(yù)防乳腺癌治療耐藥中發(fā)揮重要作用，成為個(gè)性化醫(yī)學(xué)的重要工具［25］。

3.4 CRISPR?Cas9在其它疾病耐藥中的應(yīng)用

CRISPR?Cas9文庫(kù)早期經(jīng)常應(yīng)用于藥物作用基因篩選。Shalem等［26］設(shè)計(jì)了CRISPR?Cas9基因敲除文庫(kù)，并命名為GeCKO（Genome?scale CRIS?PR?Cas9 knockout）文 庫(kù)。加 入vemurafenib抑 制A 375細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而富集少數(shù)具有vemurafenib抗性的細(xì)胞，其中nf2、cul3、tada2b和tada1與vemu?rafenib抗性無(wú)關(guān)。這些候選基因?yàn)関emurafenib腫瘤的耐藥機(jī)制提供了新的假說(shuō)。研究者還證明了CRISPR?Cas9用 于 耐 藥 基 因 篩 選 的 可 靠 性［27］。Zhou等［28］設(shè)計(jì)了一個(gè)針對(duì)這291個(gè)靶向基因，除已知的炭疽受體Antxr1外含有869條sgRNA基因的慢病毒聚焦人力資源庫(kù)。這種聚焦文庫(kù)減少了篩選范圍、實(shí)驗(yàn)成本及操作難度。選擇合適的庫(kù)容量可以更有效地篩選庫(kù)，提高實(shí)驗(yàn)成功率。

4 展望

CRISPR?Cas9基因組編輯技術(shù)是二十一世紀(jì)的一項(xiàng)重大的科學(xué)突破，推動(dòng)了生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究，對(duì)基礎(chǔ)科研領(lǐng)域產(chǎn)生了革命性的影響，在未來(lái)，CRIS?PR?Cas9技術(shù)的應(yīng)用也必將越來(lái)越廣泛。自2014年以來(lái)，利用該技術(shù)研究人員在藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、基因功能研究、藥物敏感基因研究、病毒宿主研究等領(lǐng)域取得了巨大的成功?；贑RISPR?Cas9的高通量功能性篩選技術(shù)將成為功能基因研究的首選工具。