閆錕儒， 吳亞云

貴州醫(yī)科大學(xué) 感染性疾病科，貴州 貴陽 550025

人和動物腸道中具有非常復(fù)雜而平衡的微生物群，這些微生物通常可以起到如下作用：(1)營養(yǎng)[1]；(2)防御[2]；(3)免疫調(diào)節(jié)[3]；(4)促進生長、抗衰老及抑制腫瘤[4]。突然改變膳食、緊張或使用抗生素會擾亂這種微生物群平衡，使宿主易患病及降低對食物的利用效率。益生菌具有重建自然平衡和使宿主恢復(fù)正常健康和營養(yǎng)狀況的能力。攝入益生菌以調(diào)節(jié)腸道菌群分布對于病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病[5]及酒精性肝病[6]等肝疾病所致肝纖維化有明確的治療效果。筆者課題組也有研究表明，雙歧桿菌、苗族腌湯通過上調(diào)肝組織中白介素-22水平、保護腸黏膜機械屏障，可之治療硫代乙酰胺所致急性肝衰竭[7-8]。秀麗隱桿線蟲具有較簡單的腸道結(jié)構(gòu)，其細胞內(nèi)部基因調(diào)控相關(guān)研究已經(jīng)較為深入，其與哺乳動物間存在高度的保守性，也符合無特定病原體動物以及無菌動物的標準，可視為良好的動物模型[9]。本文對目前秀麗隱桿線蟲對益生菌鑒定的優(yōu)勢及研究進展作以綜述。

1 益生菌與肝纖維化

肝纖維化作為病理生理過程，主要是由外界的各種致病因子導(dǎo)致肝內(nèi)的結(jié)締組織出現(xiàn)增生異常，其按照病因可分為病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病[10]、酒精性肝病及自身免疫性肝病等。益生菌，也被稱為“新的虛擬代謝器官”，與許多睪丸外器官形成軸樣關(guān)系。腸-肝軸[11]是胃腸道和肝之間緊密的解剖和功能雙向相互作用的結(jié)果，主要通過門靜脈循環(huán)。肝與腸道菌群間的共生關(guān)系是由一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)和穩(wěn)定的，該網(wǎng)絡(luò)包括免疫、代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌間的相互作用[12]。腸上皮內(nèi)緊密連接是細菌及其代謝產(chǎn)物的天然屏障[13]。來自病原微生物的抗原可以通過這些連接激活人體的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。與病原體密切相關(guān)的小分子物質(zhì)(PAMPs)，可以利用NOD樣受體及TOLL樣受體來激活核轉(zhuǎn)錄因子κB，進而分泌大量趨化因子和炎性因子進入門靜脈循環(huán)。除肝細胞損傷外，PAMPs還能夠激活并參與調(diào)控纖維化的星形細胞，而Kupffer細胞對脂肪酶產(chǎn)生的反應(yīng)強過肝細胞[14]。故腸-肝軸對肝疾病影響及發(fā)病機制是目前臨床研究的熱點之一。

2 秀麗隱桿線蟲應(yīng)用于益生菌的研究

2.1 秀麗隱桿線蟲應(yīng)用于乳桿菌的研究 Schifano等[15]發(fā)現(xiàn)，從食源性微生物群中分離的發(fā)酵乳桿菌MBC2對秀麗隱桿線蟲的壽命、能量代謝和抗氧化應(yīng)激有明顯的正向影響，參與其中的分子依賴于寡肽轉(zhuǎn)運體1和轉(zhuǎn)錄因子DAF-16，這表明其可能參與了宿主與微生物的相互作用。Sharma等[16]基于存活率的Kaplan Meier法表明，益生菌培養(yǎng)通過線蟲腸道的粘附和進一步定植延長了線蟲的壽命，該研究的觀察結(jié)果提示，益生菌培養(yǎng)可以延長蠕蟲的壽命，而不喪失任何生理功能。de Barros等[17]分析了25株從臨床患者體內(nèi)分離的乳酸菌，在體外降低白色念珠菌絲(Candida albicansATCC 18804)形成的能力，被感染的秀麗隱桿線蟲的存活率提高了29%。加氏乳桿菌SBT2055是一種乳酸菌益生菌。Kobatake等[18]證明了加氏乳桿菌SBT2055飼育延長了秀麗隱桿線蟲的壽命，其延長壽命的作用依賴于氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。加氏乳桿菌SBT2055處理抑制了百草枯處理細胞的這些反應(yīng)，說明加氏乳桿菌SBT2055對哺乳動物細胞的氧化應(yīng)激具有保護作用。細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)已成為宿主與病原體相互作用的潛在重要介質(zhì)。Li等[19]利用秀麗隱桿線蟲和人類細胞，研究了植物乳桿菌產(chǎn)生的EVs在調(diào)節(jié)宿主對萬古霉素耐藥糞腸球菌反應(yīng)中的作用，結(jié)果顯示，植物乳桿菌WCFS1產(chǎn)生的EVs可上調(diào)宿主防御基因的表達，并對宿主提供保護作用。Azat等[20]從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵干酪中分離得到6株乳酸菌，對其功能特性、益生菌特性及作為發(fā)酵劑的潛力進行了評價，6株菌株均耐酸性和膽鹽條件，其中，鼠李糖乳桿菌R4表現(xiàn)出較好的抗菌、自動聚集、疏水、降脂及自由基清除活性。為了進一步研究這些實驗室菌株對宿主壽命的促進作用，該研究使用秀麗隱桿線蟲作為體內(nèi)模型，與喂食大腸桿菌OP50的線蟲相比，喂食鼠李糖乳桿菌R4作為食物來源的線蟲的壽命顯著延長。

2.2 秀麗隱桿線蟲應(yīng)用于雙歧桿菌的研究 Sugawara等[21]闡明了滅活雙歧桿菌對秀麗隱桿線蟲的幾種生理作用，包括增強抗應(yīng)激能力、提高運動能力和延長壽命。DAF-16和SIR-2.1分別介導(dǎo)熱應(yīng)激耐受和壽命，滅活雙歧桿菌劑量依賴于激活DAF-16，DAF-16核易位延長秀麗隱桿線蟲的壽命，其通過SIR-2.1激活DAF-16誘導(dǎo)延長壽命。DAF-16結(jié)合HSF-1誘導(dǎo)hsp-12.6基因的表達，HSF-1可以被激活，并與DAF-16在細胞核中進行翻譯。因此，滅活雙歧桿菌的生理作用依賴于DAF-16。Zhao等[22]利用秀麗隱桿線蟲模型，闡明了不同的信號通路，特別是DAF-16通路對延長壽命的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌菌株BB68通過激活TIR-1-JNK-1-DAF-16信號通路，延長線蟲的壽命，且該菌株的細胞壁成分有助于延長線蟲的壽命。Martorell等[23]研究發(fā)現(xiàn)，通過益生菌補充劑調(diào)節(jié)微生物群對支持肥胖治療具有重要意義，該研究探討了雙歧桿菌的功能作用及其代謝靶點，動物雙歧桿菌亞種乳酸乳球菌CECT 8145篩選自秀麗隱桿線蟲，該菌株可顯著降低總脂肪和甘油三酯水平，對線蟲具有抗氧化作用。

2.3 秀麗隱桿線蟲應(yīng)用于革蘭氏陽性球菌的研究 Chelliah等[24]通過研究韓國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的乳酸菌的體內(nèi)外益生菌特性，發(fā)現(xiàn)特定的乳酸片球菌(P.acidilactici DM-9)、短屬片球菌(L.brevis SDL1411)、戊糖片球菌(P.pentosaceus SDL1409)在模擬腸液中表現(xiàn)出耐酸(66%～91%)、抗胃蛋白酶(64%～67%)和存活能力(67%～73%)，該研究表明秀麗隱桿線蟲可能是篩選有效益生菌的一個易于處理的模型。埃氏巨型球菌寄生在人的腸道內(nèi)，具有益生菌的潛力。Kwon等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與標準食物大腸桿菌OP50相比，埃氏巨型球菌顯著延長了秀麗隱桿線蟲的壽命，可以延緩衰老，并增強了秀麗隱桿線蟲對人類病原體傷寒沙門氏菌的抵抗力。Neuhaus等[26]研究發(fā)現(xiàn)，與無毒細菌相比，腸出血性大腸桿菌O157:H7可縮短秀麗隱桿線蟲的壽命，將腸出血性大腸桿菌O157:H7與糞腸球菌共同喂養(yǎng)可顯著延長線蟲的壽命，在糞腸球菌存在下，幾種病毒相關(guān)基因，包括毒力關(guān)鍵基因(如毒力島、鞭毛、群體感應(yīng)系統(tǒng))下調(diào)，進而考慮糞腸球菌在線蟲模型中是一種保護性益生菌。

2.4 秀麗隱桿線蟲應(yīng)用于其他益生菌的研究 Kato等[27]研究證明，丁酸梭菌MIYAIRI 588(clostridium butyricum MIYAIRI 588，CBM 588)可延長秀麗隱桿線蟲的壽命，所涉及的機制依賴于DAF-16/FOXO和SKN-1/Nrf2轉(zhuǎn)錄因子，DAF-16依賴Ⅱ類基因受CBM 588調(diào)控，CBM 588可能通過調(diào)節(jié)DAF-16途徑發(fā)揮其延長壽命的作用。因此，調(diào)控益生菌CBM 588作用的DAF-16依賴機制值得研究。Sharma等[28]報道了益生菌對秀麗隱桿線蟲模型系統(tǒng)中大腸桿菌的抗菌活性和競爭性排斥能力，利用益生菌對寄主進行預(yù)處理是預(yù)防病原菌感染、侵襲和進一步定植的最佳策略。Olgun等[29]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以通過降低細菌的葉酸和蛋氨酸產(chǎn)量來延長秀麗隱桿線蟲的壽命，但這可能會擾亂腸道微生物群的平衡，從而導(dǎo)致胃腸道不良反應(yīng)。故全球數(shù)百萬2型糖尿病患者可以通過補充葉酸來治療二甲雙胍引起的胃腸道不良反應(yīng)，即腹瀉。Han等[30]通過對3983種大腸桿菌活性物質(zhì)的篩選，發(fā)現(xiàn)29種細菌基因被刪除后，能夠延長宿主秀麗隱桿線蟲的壽命，這些細菌突變體中的一部分還能保護宿主免受與年齡進展相關(guān)的腫瘤生長和淀粉樣蛋白積累；該研究還發(fā)現(xiàn)了5種細菌突變體通過增加分泌莢膜異多糖酸酸來延長壽命，其可調(diào)節(jié)宿主的線粒體動力及未折疊蛋白反應(yīng)。Donato等[31]利用芽孢形成的枯草桿菌和秀麗隱桿線蟲模型，探討益生菌對寄主壽命的影響機制，該研究發(fā)現(xiàn)，富含生物膜的枯草桿菌在秀麗隱桿線蟲的腸道中定植，延長蠕蟲的壽命明顯長于缺乏生物膜的同基因菌株。枯草桿菌的長壽效應(yīng)主要是由于胰島素樣信號系統(tǒng)的下調(diào)，而胰島素樣信號系統(tǒng)正是人類百歲老人健康長壽的關(guān)鍵。這些發(fā)現(xiàn)提示，在食品和飲料中經(jīng)常食用枯草桿菌或許能顯著延長人類的預(yù)期壽命，并有助于阻止與年齡有關(guān)的疾病的進展。Hwang等[32]開發(fā)的工程益生菌(大腸桿菌1917)在兩種動物模型體內(nèi)對銅綠假單胞菌的腸道感染具有預(yù)防和治療作用，這些發(fā)現(xiàn)支持工程微生物的進一步發(fā)展，具有潛在的預(yù)防和治療腸道感染的活性。

3 展望

秀麗隱桿線蟲作為益生菌研究的重要模型，主要是由于其具有模式生物的諸多優(yōu)勢：(1)線蟲的世代周期較短，僅3 d左右，且線蟲的整體壽命接近3周，實驗操作的周期很短。(2)容易培養(yǎng)和操作。線蟲的個體較小，食物為大腸桿菌OP50，非常容易得到。線蟲的凍存及活化操作簡便，且具有極強的繁殖力，卵數(shù)量多，成活率高，容易得到同期化的線蟲，極大降低了實驗誤差。并且，線蟲具有獨特的自體受精手段，無需考慮其親緣關(guān)系對實驗產(chǎn)生的影響，提髙了實驗結(jié)果的準確性。(3)線蟲的身體透明，脂肪顆粒標記簡單，大多存在于腸道和皮下組織，容易選擇染色試劑，染色后采用顯微鏡即可觀察到線蟲體內(nèi)脂肪是否發(fā)生聚集[33]。(4)線蟲作為多細胞真核生物，具有與高等動物類似的細胞結(jié)構(gòu)。(5)線蟲己經(jīng)完成了全基因組測序，具有清楚的遺傳背景。60%～80%的線蟲基因和人類基因是高度保守的，多條信號途徑也與人類類似。(6)線蟲體內(nèi)的脂肪酸合成、代謝通路與人類具有高度的相似性，83%蛋白質(zhì)組序列與人類具有同源性[34-35]。

目前，本課題組擬進一步研究苗族腌湯所包含的益生菌，對于病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及酒精性肝病等肝疾病所致肝纖維化的治療作用。秀麗隱桿線蟲為該研究提供了一種簡易的動物模型，同時也為其他益生菌(如雙歧桿菌、芽孢桿菌等)和病原菌的研究提供了新的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>