汪楓樺 陳潔瓊 孫曉東

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院眼科 上海眼視覺與光醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心 200080

從20世紀(jì)90年代早期開始，基因治療開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。近十年來，新的基因載體、基因編輯技術(shù)以及細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)研究取得了較大進(jìn)展，為基因治療的安全性和有效性提供了支撐。2017年，作為全球首個(gè)遺傳性視網(wǎng)膜疾病(inherited retinal diseases，IRDs)的基因治療藥物，用于治療先天性黑矇的RPE65基因產(chǎn)品Luxturna獲得美國FDA批準(zhǔn)，開創(chuàng)了基因治療的新篇章。目前，基因治療從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，掀起了新的醫(yī)學(xué)革命，而加深對(duì)罕見遺傳性疾病自然病程的認(rèn)識(shí)、保障病毒載體的安全性、臨床級(jí)病毒載體的制備及其標(biāo)準(zhǔn)的建立、臨床研究終點(diǎn)觀察指標(biāo)和倫理監(jiān)管，均是基因療法臨床實(shí)踐和療效評(píng)價(jià)中面臨的關(guān)鍵問題和挑戰(zhàn)。因此開展IRDs相關(guān)的基因治療臨床試驗(yàn)須首先充分考慮上述問題，完善診療體系，建立合理可循的制度和規(guī)范化流程。

1 對(duì)IRDs臨床特征和自然病程的全面了解是開展基因治療的前提

目前基因療法是改善IRDs患者視功能有效且可行的方法，但基因療法的實(shí)施需基于對(duì)IRDs發(fā)病機(jī)制、自然病程、臨床特征和遺傳規(guī)律的深入認(rèn)識(shí)。2018年，美國FDA《視網(wǎng)膜疾病的人類基因療法指南》中第1條明確指出，深入研究IRDs的臨床特征和自然病程是基因治療藥物研發(fā)的重要前提和基礎(chǔ)。雖然近年來基因測(cè)序技術(shù)取得了長足進(jìn)步且檢測(cè)成本大幅下降，但I(xiàn)RDs具有高度遺傳異質(zhì)性和臨床異質(zhì)性[1]，因此與其他眼科常見病相比，IRDs患病率較低，患者年齡段跨度大，臨床表型差異大，基因突變類型多樣化，綜合的基因診斷和臨床診斷過程復(fù)雜且相對(duì)不明確。例如，Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)患兒視力常為20/200～光感，甚至無光感，眼底表現(xiàn)可大致正常，也可出現(xiàn)各種異常表現(xiàn)，包括椒鹽樣或錢幣樣色素沉積、黃斑萎縮或缺損、視網(wǎng)膜白色斑點(diǎn)等[2]。隨著年齡的增長和病情變化，LCA患者的視功能和眼底損害逐漸進(jìn)展，疾病晚期大量視細(xì)胞凋亡，若此時(shí)選擇基因治療，則由于缺乏功能正常的宿主細(xì)胞而表現(xiàn)為治療無效。先天性視網(wǎng)膜劈裂癥通常為中度視力損傷，未累及黃斑區(qū)時(shí)可保持較好的中心視力，但多數(shù)患者50～60歲時(shí)視力明顯減退，黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮發(fā)生萎縮[3]，基因治療效果也欠佳。因此，只有全面了解IRDs的自然病程規(guī)律和特點(diǎn)，才能確定基因治療中最佳“治療窗”和臨床終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

目前，國外已有多個(gè)IRDs自然病程的系統(tǒng)性觀察研究[4-5]，我國作為人口大國，人群疾病譜廣，存在民族和地域差異。中國人群中IRDs病變特征與西方人群顯著不同，如西方人群中CEP290c.2991+1655A>G(p.Cys998X)為LCA常見的致病突變位點(diǎn)[6-7]，但該位點(diǎn)在我國LCA患者中極少報(bào)道。目前，我國對(duì)IRDs的自然病程研究僅限于很少量的橫斷面研究[8-10]。因此，亟需開展基于我國人群遺傳背景的前瞻性自然病程研究，深入、系統(tǒng)地觀察不同基因突變引起的中國人群IRDs的臨床特征和自然病程規(guī)律，為精準(zhǔn)基因治療以及臨床適用的治療操作技術(shù)和評(píng)價(jià)技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

2 基因治療載體的安全性是基因治療成功的關(guān)鍵

已上市的基因替代療法是通過載體將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者的細(xì)胞中，并表達(dá)功能正常的蛋白，以達(dá)到治療效果，載體相關(guān)的免疫原性及其與宿主基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)是基因治療安全性的關(guān)注熱點(diǎn)。理想的載體應(yīng)滿足嚴(yán)格規(guī)范的表達(dá)、低不良反應(yīng)、持續(xù)可控的治療效果、靶細(xì)胞特異性以及足夠的DNA容量等條件[11]。目前大部分研究是使用腺病毒、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)和慢病毒等病毒載體遞送系統(tǒng)，各具優(yōu)缺點(diǎn)。AAV具有無致病性、高效長期表達(dá)、易于基因操作以及低免疫原性的特點(diǎn)，在基因治療臨床研究中應(yīng)用較多，例如美國Spark Therapeutics公司開發(fā)的Luxturna即采用2型AAV作為遞送載體，能夠安全、有效地靶向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因增補(bǔ)治療的目標(biāo)[12]。

由于AAV在人群中存在普遍感染的問題，因此宿主體內(nèi)針對(duì)各種AAV血清型的體液免疫應(yīng)答是AAV用于基因治療的挑戰(zhàn)。人群中96%的人具有抗AAV中和抗體，其中32%的人能夠完全中和AAV[13]。Boutin等[14]研究發(fā)現(xiàn)，人群中抗AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9中和抗體的血清陽性率分別約為67%、72%、40%、46%、30%和47%。目前認(rèn)為AAV中和抗體的存在是導(dǎo)致早期基因治療臨床試驗(yàn)失敗的主要因素之一[15]。然而，美國應(yīng)用基因技術(shù)公司研究人員發(fā)現(xiàn)，眼內(nèi)給予AAV治療后，受試者血清或眼部存在的AAV中和抗體并不會(huì)影響基因遞送、表達(dá)或眼部炎癥反應(yīng)，這是由于眼球本身為相對(duì)獨(dú)立的器官，具有相對(duì)免疫豁免特性，同時(shí)與其他器官相比，眼球體積較小，對(duì)有效治療量的基因治療載體數(shù)量所需較少，治療劑量所產(chǎn)生的抗AAV中和抗體影響較小(https://www.biospace.com)。但是當(dāng)眼部處于疾病狀態(tài)時(shí)，眼球的免疫屏障受到破壞，抗AAV中和抗體相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)明顯增大。因此，有研究者推薦進(jìn)行基于AAV的基因治療時(shí)應(yīng)針對(duì)特定AAV的中和抗體進(jìn)行檢測(cè)，并確定最佳給藥途徑[16]。

盡管大量臨床研究在一定程度上顯示了AAV載體的安全性，但其在基因治療中的安全性問題仍受到高度關(guān)注。已有研究認(rèn)為基因治療過程中靜脈注射高劑量AAV會(huì)產(chǎn)生毒性反應(yīng)，引起肝功能嚴(yán)重?fù)p害[17]。近期美國Audentes Therapeutics公司提供的AT132基因療法的臨床試驗(yàn)先后出現(xiàn)3例死亡事件，再次引起研究者對(duì)AAV載體安全性的關(guān)注。該基因療法采用的是8型AAV載體，受試者在接受高劑量病毒載體注射后因出現(xiàn)敗血癥或胃腸道出血癥狀而導(dǎo)致死亡(https://www.audentestx.com)。因此，基因治療中高劑量AAV注射引起嚴(yán)重并發(fā)癥的機(jī)制及相應(yīng)的解決方案值得深入探索。

同時(shí)在臨床及臨床前研究中依然發(fā)現(xiàn)AAV攜帶的治療基因整合進(jìn)入宿主基因組的現(xiàn)象。Inagaki等[18]研究發(fā)現(xiàn)，新生小鼠體內(nèi)注入AAV后其攜帶的遺傳物質(zhì)整合入宿主基因組中并發(fā)生了肝癌；近期Kaiser[19]對(duì)犬進(jìn)行AAV基因治療后在犬的染色體上檢測(cè)到AAV攜帶的治療性基因片段，有些甚至位于與生長相關(guān)的基因附近，推測(cè)存在誘發(fā)癌癥的可能性。由此提示我們，AAV病毒載體在基因治療中依然存在潛在的成瘤風(fēng)險(xiǎn)。在未來的基因治療研究中，如何精準(zhǔn)地導(dǎo)入目的基因并維持長期、有效、安全的表達(dá)仍是基因治療的一個(gè)挑戰(zhàn)。

3 GMP級(jí)規(guī)模化病毒載體生產(chǎn)是目前基因治療產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸

病毒載體比傳統(tǒng)生物制劑的制作生產(chǎn)過程復(fù)雜得多，開發(fā)并定制病毒的周期長，同時(shí)研發(fā)費(fèi)用高昂，因此大規(guī)模生產(chǎn)和制備合格的GMP級(jí)病毒載體是目前基因治療產(chǎn)業(yè)化的瓶頸問題。成熟的AAV生產(chǎn)工藝必須能夠提供高度一致、高純度和高滴度的病毒產(chǎn)品，同時(shí)滿足監(jiān)管中的安全性和有效性要求并能夠降低成本。

病毒的生產(chǎn)流程可分為上游的擴(kuò)增病毒和下游的純化病毒，目前業(yè)界仍然缺少AAV病毒生產(chǎn)的規(guī)?；?、工業(yè)化平臺(tái)。在目前的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，通過改進(jìn)轉(zhuǎn)染技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)方法可以達(dá)到大規(guī)模病毒擴(kuò)增的目的，如何高效、穩(wěn)定地從大量細(xì)胞裂解物中純化AAV是目前面臨的主要挑戰(zhàn)。病毒顆粒的下游純化主要是去除工藝和產(chǎn)品的相關(guān)雜質(zhì)，包括宿主細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)、質(zhì)粒DNA和病毒空殼，這些步驟的處理在生產(chǎn)總成本中占據(jù)很大比重，而其中的主要雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)，由于受到宿主細(xì)胞DNA組蛋白的保護(hù)，且市售核酸酶很難分解染色質(zhì)，同時(shí)該過程涉及多個(gè)步驟，顯著降低回收率，因此實(shí)驗(yàn)室的成功純化工藝難以擴(kuò)展至大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。

4 基因治療產(chǎn)品管理規(guī)范的建立是基因治療的“門檻”

大規(guī)模開展基因治療的臨床研究應(yīng)有完善的基因治療產(chǎn)品管理和評(píng)價(jià)規(guī)范作為保障。目前全球都是將基因治療產(chǎn)品作為藥品來申報(bào)和監(jiān)管，對(duì)于全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)來說，這是一個(gè)全新的產(chǎn)業(yè)，僅有數(shù)款產(chǎn)品作為孤兒藥獲批上市，監(jiān)管依然面臨挑戰(zhàn)。中國面臨的更大挑戰(zhàn)是基因治療相關(guān)的產(chǎn)業(yè)在國內(nèi)剛剛興起，目前國內(nèi)整套質(zhì)量監(jiān)控法規(guī)管理體系尚未健全。2020年9月，中國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心頒布了《基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(征求意見稿)》，基于當(dāng)前的技術(shù)發(fā)展和科學(xué)認(rèn)知，針對(duì)基因治療藥學(xué)研究的特殊性提出要求，以確保研究和治療用藥品的質(zhì)量、安全性和有效性，目的是規(guī)范和指導(dǎo)基因治療產(chǎn)品按照藥品管理規(guī)范進(jìn)行研究、開發(fā)和評(píng)價(jià)。病毒載體作為基因治療的臨床治療劑，首先應(yīng)符合中國國家藥典委員會(huì)2019年公示的《人用基因治療制品總論》的要求，同時(shí)應(yīng)滿足《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的基本原則和相關(guān)要求，重點(diǎn)關(guān)注生產(chǎn)過程中外源因子的污染和交叉污染、生產(chǎn)人員的健康和安全防護(hù)、生產(chǎn)環(huán)境的生物等級(jí)和安全隔離，以及生產(chǎn)產(chǎn)物或廢棄物對(duì)環(huán)境的生物安全性影響。

在病毒載體進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)制備的生產(chǎn)工藝中，首先需要建立符合要求的載體車間，對(duì)儀器設(shè)備、人員構(gòu)成、選址、生物安全防護(hù)、能耗和環(huán)境評(píng)價(jià)等方面進(jìn)行周密設(shè)計(jì)，以建立起一個(gè)合格的GMP級(jí)工廠[20]。病毒載體的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得質(zhì)量控制測(cè)試更為復(fù)雜，同時(shí)由于基因治療產(chǎn)品儲(chǔ)存對(duì)時(shí)效性要求較高，在質(zhì)量控制檢測(cè)中需要更高要求的快速檢測(cè)方法和準(zhǔn)確性，因此建立企業(yè)質(zhì)量控制和放行測(cè)試是確保產(chǎn)品安全性、純度和效力的重要環(huán)節(jié)。

基因治療產(chǎn)品涉及體內(nèi)生物學(xué)過程，雖然企業(yè)均有放行標(biāo)準(zhǔn)，但是否足以保證產(chǎn)品的質(zhì)量依然是難以確保的問題?；蛑委煯a(chǎn)品的溫度敏感特性對(duì)冷鏈運(yùn)輸也提出了挑戰(zhàn)，例如Luxturna必須在-65 ℃條件下進(jìn)行運(yùn)輸和保存。同時(shí)國內(nèi)已有多家醫(yī)院開展了關(guān)于IRDs基因治療研究者發(fā)起的臨床試驗(yàn)，是否需要建立院前放行標(biāo)準(zhǔn)，以及建立怎樣的快速檢測(cè)指標(biāo)來確保受試者的安全是值得進(jìn)一步探討的重要問題。

5 確定有效可行的臨床研究方案和合理的倫理監(jiān)管是基因治療的保障

截至2020年9月，全球已開展44項(xiàng)IRDs相關(guān)的基因治療臨床試驗(yàn)研究(https://clinicaltrials.gov)，雖然第1例LCARPE65基因治療藥物L(fēng)uxturna的研發(fā)成功為眼科基因治療提供了典范，但I(xiàn)RDs是一系列罕見、視網(wǎng)膜進(jìn)行性退化的基因缺陷相關(guān)疾病，包括視網(wǎng)膜色素變性、無脈絡(luò)膜癥、Leber遺傳性視神經(jīng)病變、LCA、Stargardt病和X連鎖視網(wǎng)膜劈裂等。由于這些疾病之間有著不同的致病基因和發(fā)病機(jī)制以及其臨床特征多樣化和病程不等的特點(diǎn)，難以設(shè)定統(tǒng)一的臨床觀察指標(biāo)，給臨床研究具體方案的設(shè)計(jì)和實(shí)施提出了挑戰(zhàn)。因此，針對(duì)特定基因?qū)е碌奶囟膊?，個(gè)性化選擇主要和次要研究終點(diǎn)、制定詳細(xì)的患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn)在基因治療臨床試驗(yàn)中至關(guān)重要。

基因治療仍處于治療疾病的早期階段，所預(yù)期的獲益或風(fēng)險(xiǎn)存在很大的不確定性，如何規(guī)范有效地保護(hù)患者的利益是基因治療倫理監(jiān)管的重要關(guān)注點(diǎn)。1999年，基因治療領(lǐng)域的先鋒James Wilson教授對(duì)1例鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺陷癥患者進(jìn)行基因治療，患者全身發(fā)生免疫系統(tǒng)反應(yīng)引起器官衰竭而死亡。由于在這項(xiàng)研究中研究者的臨床前數(shù)據(jù)不透明、受試者風(fēng)險(xiǎn)告知不充分所引起的后果引發(fā)了基因治療的倫理爭(zhēng)論，因此之后的基因治療倫理審查中強(qiáng)調(diào)，參與基因治療研究者在設(shè)計(jì)基因治療方案時(shí)應(yīng)以全人類的利益為出發(fā)點(diǎn)，尊重人類自身而開展基因治療研究，也應(yīng)盡可能全面地獲得對(duì)這一新技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)和控制的能力，即“舉證責(zé)任”，應(yīng)明確無誤地告知受試者和研究者在基因治療的探索中做了什么、為何而做以及可能產(chǎn)生怎樣的后果，讓公眾在完全知曉的前提下自愿選擇。

6 嚴(yán)格遵守《中華人民共和國人類遺傳資源管理?xiàng)l例》是開展基因治療的必要前提

根據(jù)國務(wù)院在2019年7月頒布的《中華人民共和國人類遺傳資源管理?xiàng)l例》，在合理開展基因治療研究的過程中，研究者所涉及人體遺傳樣本的收集、調(diào)查和分析均屬于我國人類遺傳資源[21]。當(dāng)研究對(duì)象為重要的遺傳家系和特定地區(qū)的人類遺傳資源時(shí)應(yīng)當(dāng)實(shí)行申報(bào)登記制度，保護(hù)和合理利用我國人類遺傳資源，維護(hù)公眾健康、國家安全和社會(huì)公共利益。

該條例表明，國家支持研究者合理利用人類遺傳資源開展科學(xué)研究、發(fā)展生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、提高診療技術(shù)，以提高我國生物安全的保障能力，提升人民健康保障水平，對(duì)利用人類遺傳資源開展研究開發(fā)活動(dòng)以及成果的產(chǎn)業(yè)化依照法律、行政法規(guī)和國家有關(guān)規(guī)定予以支持。但研究的同時(shí)不得超越5條“紅線”：(1)采集、保藏、利用、對(duì)外提供我國人類遺傳資源不得危害我國公眾健康、國家安全和社會(huì)公共利益；(2)應(yīng)符合倫理原則，并按照國家有關(guān)規(guī)定進(jìn)行倫理審查；(3)應(yīng)尊重人類遺傳資源提供者的隱私，取得其事先知情同意，并保護(hù)其合法權(quán)益；(4)禁止買賣人類遺傳資源；(5)外國組織、個(gè)人及其設(shè)立或者實(shí)際控制的機(jī)構(gòu)不得在我國境內(nèi)采集、保藏我國人類遺傳資源，不得向境外提供我國人類遺傳資源。

7 關(guān)注IRDs基因療法的研究方向以合理開展相關(guān)研究

盡管基因治療還存在許多關(guān)鍵性技術(shù)問題以及臨床研究和治療應(yīng)用的監(jiān)管和法規(guī)有待進(jìn)一步完善，但對(duì)于很多目前無法治療的疾病，基因治療是值得期待的治療方式。目前，基因治療研究主要聚焦于罕見的單基因遺傳病和腫瘤領(lǐng)域。在眼科的新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性中，針對(duì)關(guān)鍵致病因子血管內(nèi)皮生長因子開展了多個(gè)基因治療臨床試驗(yàn)，取得了鼓舞人心的效果，在一項(xiàng)Ⅱa期的臨床試驗(yàn)中，新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性患者在進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔注射rAAV.sFlt-1后視力獲得顯著提高[22]。更值得期待的是，基因治療并非僅用于罕見病的治療，隨著新技術(shù)、新理論的出現(xiàn)和改進(jìn)，未來有望將基因治療擴(kuò)展應(yīng)用到更為常見的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子和營養(yǎng)因子相關(guān)疾病，如心血管病、糖尿病、阿爾茨海默癥、帕金森癥、精神分裂癥等，基因治療作為一種全新的給藥治療方式，為需要持續(xù)給藥的疾病提供全新的治療手段。目前基因治療主要采用基因增補(bǔ)技術(shù)，隨著新的基因編輯技術(shù)以及細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，未來也將開展更多類型的基因治療方式。隨著對(duì)基因治療載體功能和安全性的不斷改進(jìn)，未來將進(jìn)一步克服病毒載體的免疫原性，更加精準(zhǔn)地表達(dá)并增加病毒裝載容量，優(yōu)化治療過程，在基因治療制劑的工藝制備中，優(yōu)化各個(gè)環(huán)節(jié)并降低生產(chǎn)成本，獲得高效、穩(wěn)定的基因治療制劑。目前，基因治療猶如十年前的生物抗體藥物應(yīng)用初期一樣，仍處于起步階段，隨著相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和研究工作的日臻成熟，生產(chǎn)出患者可耐受的高質(zhì)量、安全的基因治療產(chǎn)品是未來的方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突