鄭巍 李海波 張雪詠 周學智 陳媛媛 毛俊峰

中南大學湘雅醫(yī)院眼科，長沙 410008

家族性玻璃體淀粉樣變性(familial vitreous amyloidosis，F(xiàn)VA)是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，因淀粉樣物質在玻璃體內的沉積而致病，可獨立發(fā)病，也可同時累及全身多個器官和組織[1]，其發(fā)病與轉甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)基因突變密切相關。TTR主要由肝臟(約占90%)、脈絡叢及視網(wǎng)膜色素上皮細胞合成，目前已報道的TTR基因致病性突變有100多種，存在一定的種族及地域差異性[2-4]。本研究收集并分析2個FVA家系的臨床資料，以進一步探討我國漢族人群玻璃體淀粉樣變性的臨床特征及基因突變位點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調查研究，收集2015年1月至2018年12月于中南大學湘雅醫(yī)院就診的2個漢族玻璃體淀粉樣變性家系。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)中南大學湘雅醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(批文號：201412463)。所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1全身及眼部檢查 詳細記錄2個家系所有成員的病史和家族史，并進行全身體格檢查、心電圖、胸部正側位片和眼部檢查(包括視力、裂隙燈顯微鏡、眼底、眼壓、眼部B型超聲檢查)。

1.2.2基因測序 采集家系1(湖南株洲，MZ001)中15例患者(男9例，女6例)、家系2(湖南常德，MZ002)中7例患者(男2例，女5例，I2未納入)以及家系1、家系2中各5名無臨床癥狀者外周靜脈全血各5 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸抗凝，采用酚/氯仿法抽提gDNA。采用PCR試劑盒(上海生工生物技術有限公司)在ABI-2720 PCR擴增儀(美國ABI公司)上擴增TTR基因的4個外顯子片段。gDNA參考序列版本為GRCh38/hg38(2013年12月發(fā)布)，引物設計與合成均由上海生工生物技術有限公司完成，4個外顯子的PCR引物設計見表1。將PCR擴增產(chǎn)物交由上海鉑尚生物技術有限公司在ABI-3730XL型測序儀(美國ABI公司)上進行雙向測序，測序結果采用SeqMan軟件和Chromas軟件進行分析，并將測序結果與野生型TTR基因完整序列的4個外顯子進行比對。

表1 TTR基因外顯子1、2、3、4的檢測引物Table 1 Primers of TTR gene exons 1,2,3 and 4引物名稱引物序列(5’-3’)產(chǎn)物大小(bp)外顯子1正向:AACGAATGTTCCGATGCTCT354反向:GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC外顯子2正向:CGTTCCTGATAATGGGATCA320反向:CTACCAAGTGAGGGGCAAAC外顯子3正向:GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT272反向:GCCAAAAGCAAAAACCAAAA外顯子4-1正向:TCTAAGGACTGTGCATGGTTCC504反向:TTTGGAAGGGACAATAAGGGAA外顯子4-2正向:GACGAGGGATGGGATTTCATGT483反向:TACACCACTGCATTCTAGCCTG 注:TTR:轉甲狀腺素蛋白 Note:TTR:transthyretin

1.2.3玻璃體切割手術 MZ001家系先證者Ⅲ13和MZ002家系先證者Ⅱ11均因玻璃體嚴重混濁行經(jīng)睫狀體平坦部23G玻璃體切割手術聯(lián)合白內障超聲乳化摘出聯(lián)合人工晶狀體植入術。行三通道玻璃體切割，術中人工誘導玻璃體后脫離，注入少量曲安奈德對玻璃體進行染色，頂壓鞏膜盡量切割周邊部玻璃體，并仔細檢查，未見視網(wǎng)膜裂孔，術中取玻璃體標本后送組織病理學檢查，術畢灌注液填充玻璃體腔。

1.2.4玻璃體標本的組織病理學檢查 術中開放氣體灌注維持眼壓，從玻璃體切割管道中直接抽取病變玻璃體進行鋪片、脫水固定。切片浸入質量分數(shù)0.5%剛果紅染液15 min，水洗后光學顯微鏡下觀察，淀粉樣變性組織呈紅色陽性反應。

2 結果

2.1 2個FVA家系成員的臨床特征

2個家系均符合常染色體顯性遺傳。MZ001家系4代共63名家系成員，其中男29人，女34人；FVA患者15例，均為雙眼發(fā)病，發(fā)病率為23.8%，發(fā)病年齡為36～51歲，平均(43.6±5.8)歲。MZ002家系4代共49人，其中男23人，女26人；FVA患者共7例，均雙眼發(fā)病，發(fā)病率為14.3%，發(fā)病年齡為43～59歲，平均(50.4±5.5)歲(圖1)。

圖1 2個FVA家系圖 A：MZ001家系 B：MZ002家系 □：健康男性；○：健康女性；■：男性患者；●：女性患者；/：已故；：先證者Figure 1 Pedigree map of MZ001 and MZ002 A:MZ001 pedigree B:MZ002 pedigree □:healthy male；○:healthy female；■:male patient；●:female patient;/:deceased；:the proband

2個家系的FVA患者具有相似的眼部臨床表現(xiàn)，雙眼同時或先后發(fā)病，結膜、角膜、前房未見淀粉樣物質沉積，房角鏡檢查各方向房角開放。晶狀體后囊可見玻璃體混濁物黏附，呈足盤樣。玻璃體內可見大量白色顆粒樣混濁物，飄動如棉紗樣，玻璃體混濁的嚴重程度隨發(fā)病時間延長而加重，嚴重者眼底結構模糊不清。B型超聲檢查顯示玻璃體中度混濁，MZ001家系先證者Ⅲ13無玻璃體后脫離，MZ002家系先證者Ⅱ11伴有扁平狀玻璃體后脫離(圖2，3)。

MZ001家系中患者均未發(fā)現(xiàn)伴有神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟、肝臟等全身其他器官系統(tǒng)疾病。MZ002家系中，有3例患者出現(xiàn)不同程度的手足麻木癥狀，無腹瀉、高血壓或頭暈等。MZ002家系Ⅱ3患者因雙眼玻璃體混濁曾先后2次在中南大學湘雅醫(yī)院行玻璃體切割術，該患者去世時有四肢麻木、嚴重的肌力下降和肌肉萎縮癥狀。

2.2 FVA患者的術中、術后臨床表現(xiàn)和特征

MZ001家系Ⅲ13患者術中發(fā)現(xiàn)玻璃體混濁黏稠、致密，誘導玻璃體后脫離較困難，在赤道部附近，玻璃體與視網(wǎng)膜粘連緊密，玻璃體難以切割干凈。MZ002家系Ⅱ11患者玻璃體混濁較松軟，術中易于誘導完全的玻璃體后脫離，并可將周邊玻璃體混濁徹底清除。玻璃體組織鋪片剛果紅染色結果顯示,淀粉樣物質呈紅色陽性反應(圖2，3)。

MZ001家系Ⅲ13患者術前眼壓為15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，術后6個月眼壓升高至30 mmHg，診斷為開角型青光眼，酒石酸溴莫尼定滴眼液點眼后眼壓可控制在正常范圍，術后1年復查發(fā)現(xiàn)玻璃體內再次出現(xiàn)白色顆粒樣混濁。MZ002家系Ⅱ11患者術前眼壓為16 mmHg，術后眼壓為13 mmHg，隨訪2年未見眼壓升高及玻璃體混濁復發(fā)。

2.3 2個FVA家系成員TTR基因序列變化

在MZ001家系的所有患者中，TTR基因第3外顯子第83位氨基酸發(fā)生突變，cDNA307位的G峰下方出現(xiàn)1個C堿基套峰，野生型無此套峰，相應的密碼子由GGC突變?yōu)镃GC(圖2)，即由甘氨酸突變?yōu)榫彼?Gly83Arg)。

圖2 MZ001家系先證者Ⅲ13眼部臨床表現(xiàn)及基因測序結果 A：裂隙燈顯微鏡照相可見足盤樣玻璃體混濁黏附于晶狀體后囊 B：眼底照相可見玻璃體大量混濁物如棉紗樣 C：B型超聲檢查示玻璃體中度混濁，無玻璃體后脫離 D：玻璃體切割術中可見后極部覆蓋曲安奈德染色的玻璃體 E：玻璃體組織病理學檢查可見玻璃體組織淀粉樣物質呈紅色陽性反應(剛果紅，標尺=200 μm) F：基因測序結果顯示TTR基因第83位氨基酸出現(xiàn)雜合突變，由GGC突變?yōu)镃GC(箭頭)，由甘氨酸突變?yōu)榫彼?Gly83Arg)Figure 2 Ocular clinical manifestations and gene sequencing of proband Ⅲ13 in MZ001 family A:The pedal disc shaped deposits were attached to the posterior lens capsule by slit lamp microscopy B:Cotton wool-like deposits in the vitreous observed by fundus photography C:Moderate vitreous opacity with no posterior detachment was found by B-ultrasound D:During vitrectomy，the posterior pole of fundus was covered with triamcinolone stained vitreous E:The vitreous tissue collected during vitrectomy was with positive Congo red staining by histopathological examination (Congo red，bar=200 μm) F:Gene sequencing results of TTR showed a G to C transversion (arrow) resulting in the replacement of glycine-83 with arginine (Gly83Arg)

在MZ002家系的所有患者中，TTR基因第2外顯子第36位氨基酸發(fā)生突變，cDNA166位的G峰出現(xiàn)1個C堿基套峰，野生型無此套峰，相應的密碼子由GCT突變?yōu)镃CT(圖3)，即由丙氨酸突變?yōu)楦彼?Ala36Pro)。

圖3 MZ002家系先證者Ⅱ11眼部臨床表現(xiàn)及基因測序結果 A：裂隙燈顯微鏡照相示晶狀體后囊白色足盤樣混濁物附著 B：眼底照相可見玻璃體混濁呈棉紗樣，眼底窺不清 C：B型超聲檢查可見玻璃體中度混濁，伴部分玻璃體后脫離 D：玻璃體切割術中可見容易誘導玻璃體后脫離，周邊玻璃體松軟 E：玻璃體組織病理學檢查可見淀粉樣物質呈紅色陽性反應(剛果紅，標尺=200 μm) F：基因測序結果顯示TTR基因第36位氨基酸出現(xiàn)雜合突變，由GCT突變?yōu)镃CT(箭頭)，由丙氨酸突變?yōu)楦彼?Ala36Pro)Figure 3 Ocular clinical manifestations and gene sequencing of the proband Ⅱ11 in MZ002 family A:The pedal disc shaped deposits were attached to the posterior lens capsule by slit lamp microscopy B:Cotton wool-like deposits in the vitreous were found by fundus photography，which lead to the blurred fundus C:Moderate vitreous opacity with no posterior detachment was found by B-ultrasound D:During vitrectomy，it was easy to induce the vitreous detachment，and the peripheral vitreous was loose E:The vitreous tissue collected during vitrectomy was with positive Congo red staining by histopathological examination (Congo red，bar=200 μm) F:Gene sequencing results of TTR showed a G to C transversion (arrow) resulting in the replacement of alanine-36 with proline (Ala36Pro)

3 討論

FVA是一種臨床罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，其發(fā)病與TTR基因突變密切相關，本研究中納入的2個家系有著不同基因突變位點，呈現(xiàn)出不同的臨床特征。MZ001家系較MZ002家系發(fā)病早，玻璃體混濁癥狀更重，其先證者周邊部玻璃體皮質黏稠致密，術中切割時需謹慎操作，避免發(fā)生醫(yī)源性視網(wǎng)膜裂孔；MZ002家系先證者的玻璃體松軟，容易誘導玻璃體后脫離，周邊的混濁玻璃體較易切凈。MZ001家系患者均不合并全身其他系統(tǒng)異常癥狀；MZ002家系中有3例患者有不同程度的手足麻木感，Ⅱ3還出現(xiàn)了嚴重的肌力下降合并肌肉萎縮癥狀，提示可能有淀粉樣物質在神經(jīng)系統(tǒng)沉積。

FVA可單獨發(fā)病，也可表現(xiàn)為家族性淀粉樣變性多發(fā)神經(jīng)病變(familial amyloid polyneuropathy，F(xiàn)AP)的眼部受累。FAP是一組常染色體顯性遺傳疾病，由淀粉樣纖維在各組織器官沉積引起，可累及全身多個系統(tǒng)，甚至危及生命[5]。淀粉樣物質在玻璃體的沉積可以是孤立發(fā)病，也可伴隨全身多系統(tǒng)受累，在目前已知的7種可導致FVA發(fā)生的突變基因中，以TTR基因突變最為常見。以往文獻報道中，Val30Met是全球范圍內TTR最常見的突變[6]。近年來，國內也有一些與FAP有關TTR基因突變的報道，如Lys35Thr、Gly83Arg、Ala36Pro、Ala97Ser、Tyr114Cys等[3,7-15]。本研究中對2個漢族FVA家系患者的檢測發(fā)現(xiàn)，這2個家系盡管均是TTR基因突變，但突變位點并不相同，分別是c.307G>C和c.166G>C，推測其可能是導致2個家系臨床表現(xiàn)存在差異的根本原因，這2個突變位點導致臨床表型不同的具體原因還有待進一步研究。目前，Gly83Arg突變僅在國內漢族家系中有發(fā)現(xiàn)，在國外其他種族中尚未見報道，該突變引起的FAP癥狀不同于其他突變，往往以眼部癥狀先發(fā)，且全身其他系統(tǒng)癥狀出現(xiàn)晚、癥狀輕，甚至不出現(xiàn)，本研究中MZ001家系FVA患者僅出現(xiàn)雙眼玻璃體混濁。也有研究表明，在轉基因小鼠模型中Gly83Arg突變導致玻璃體淀粉樣物質沉積是其唯一癥狀[16]。因此，本研究推測Gly83Arg可能是我國漢族人群玻璃體淀粉樣變性特有的突變。

玻璃體切割術是治療FVA最直接和有效的方式，但術后仍有可能復發(fā)[17-18]，術后應特別注意繼發(fā)性青光眼的監(jiān)測。MZ001家系Ⅲ13術后出現(xiàn)了開角型青光眼癥狀，而MZ002家系Ⅱ11術后并無眼壓升高。青光眼的發(fā)生一般與淀粉樣物質在小梁網(wǎng)沉積進而阻滯房水排出有關[19]。此外，MZ002家系中Ⅳ7也檢測到攜帶TTR基因Ala36Pro突變，因年齡較小目前尚未發(fā)病，有待進一步的隨訪觀察。

綜上所述，本研究結果顯示FVA可能與TTR基因的Gly83Arg或Ala36Pro突變有關，二者引起的臨床表型有所不同，其中Gly83Arg突變的患者玻璃體混濁更嚴重，發(fā)病年齡更早，不伴有全身其他器官系統(tǒng)受累，術后可伴發(fā)青光眼；而Ala36Pro突變的患者多伴有四肢麻木、肌力下降等全身癥狀，雙眼可先后發(fā)病，雙眼玻璃體混濁程度不一致，術后未伴發(fā)青光眼。本研究著重對2種突變引起FVA患者的臨床表型進行了分析和對比，對2種突變在玻璃體切割手術難易度、繼發(fā)青光眼、全身伴隨癥狀等方面進行了闡述，突變位點的致病性仍有待進一步研究證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突