張玉薇 婁桂予 楊科 陽琳 朱青 雷博

1河南省人民醫(yī)院醫(yī)學遺傳研究所 河南省遺傳性疾病功能基因重點實驗室，鄭州450003；2河南省人民醫(yī)院 河南省眼科研究所 河南省立眼科醫(yī)院，鄭州 450003

視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一類常見的遺傳性眼病，全球患病率為1/7 000～1/3 000，其在中國的患病率約為1/4 000[1-2]。RP患者多在兒童和青少年時期發(fā)病，主要表現(xiàn)為夜盲、進行性視野缺損、視力下降和視網膜骨細胞樣色素沉著，其病理過程為視桿細胞首先出現(xiàn)進行性變性，進而視錐細胞受累，最終導致視桿和視錐細胞及色素上皮功能喪失[3]。RP的診斷主要依據眼底、視網膜電圖(electroretinogram，ERG)和視野檢查，特殊情況可考慮光相干斷層掃描檢查。臨床上尚無控制RP進展及治療RP的有效方法，明確病因、植入前進行分子診斷、降低攜帶致病突變患兒的出生率是降低RP患病率的有效方法。RP具有高度遺傳異質性，目前已鑒定的致病基因約有96個(https://sph.uth.edu/retnet/)。RP的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X染色體連鎖遺傳，少數(shù)患者可表現(xiàn)為雙基因遺傳及線粒體遺傳[4]。由于RP表現(xiàn)出高度的遺傳異質性和臨床表型多樣性，鑒定RP患者的致病基因對于正確的分類和診斷至關重要[5-6]。本研究擬對常染色體顯性遺傳視網膜色素變性(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)一家系的致病基因和臨床表型進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調查研究，收集2019年11月于河南省人民醫(yī)院醫(yī)學遺傳研究所進行遺傳咨詢的來自河南省東部地區(qū)的漢族RP一家系，納入該家系4代20名成員，包括9例患者和11名表型正常者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經河南省人民醫(yī)院倫理委員會審核批準[批文號：HNEECKY-2019(15號)]，所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1臨床檢查 采用標準對數(shù)視力表(i.Polatest，德國Carl Zeiss AG公司)測定視力，免擴瞳眼底照相機(VISUCAM-200，德國Carl Zeiss AG公司)檢查眼底，眼電生理診斷系統(tǒng)(RET1-Port 21 compact，德國羅蘭公司)檢查視網膜功能，視野分析儀(840，德國Carl Zeiss AG公司)檢查視野。

1.2.2基因檢測 采集先證者及家系成員外周靜脈血各2 ml，置于EDTA抗凝管，混勻后按照DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)步驟提取DNA，Qubit?2.0(美國Life Technologies公司)對DNA定量。采用高通量測序儀(Ion Torrent PGM，美國ABI公司)進行基因檢測。

1.2.2.1Ion AmpliSeq引物包建庫及靶向測序 采用Ion AmpliSeq Designer(https://www.ampliseq.com)設計覆蓋43個RP基因外顯子區(qū)域，包含1 187個擴增子的AmpliSeq引物包，并由美國Life Technologies公司合成。按照Ion AmpliSeq Library Kit 2.0建庫試劑盒(美國Life Technologies公司)流程對先證者進行靶向外顯子建庫，Qubit-dsDNA-HS試劑盒(美國Life Technologies公司)對制備的文庫進行定量檢測，高通量測序儀測序。采用Ion Torrent Suite v5.6系統(tǒng)進行Ion Torrent數(shù)據質控、序列比對及單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)和插入缺失(inserts and deletions，indels)變異檢測。質控數(shù)據顯示，靶向外顯子平均覆蓋度為99.94%，平均測序深度為300×。得到的SNVs和indels經dbSNP 138數(shù)據庫過濾后，檢索HGMD、NCBI等數(shù)據庫匹配已報道的致病位點。對發(fā)現(xiàn)的可疑致病突變采用Sanger測序進行驗證。

1.2.2.2PCR反應及Sanger法測序 根據變異序列采用primer blast在線(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計引物，由上海生工生物有限公司合成。擴增含有變異的外顯子，對PCR片段進行純化和測序。序列數(shù)據文件采用SeqMan Pro軟件8.1.4版(DNASTAR)分析。

1.2.3數(shù)據分析 采用在線軟件(http://www.mutationtaster.org/、http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和https://swissmodel.expasy.org/)預測變異位點蛋白功能及空間結構。采用ClustalW2多重比對程序對人(Genbank：NP_000530.1)、牛(Genbank：NP_001014890.1)、家犬(Genbank：NP_001008277.1)、黑猩猩(Genbank：XP_516740.2)、貓(Genbank：NP_001009242.1)及小鼠(Genbank：NP_663358.1)視紫紅質(rhodopsin，RHO)蛋白的氨基酸序列進行比較(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。根據ACMG遺傳變異分類標準與指南判斷變異位點致病性[7]。

2 結果

2.1 家系患者臨床特點

該家系4代共有9例RP患者，符合常染色體顯性遺傳方式(圖1)。先證者，男，26歲，自幼雙眼夜盲，視力右眼0.25，左眼0.5。雙眼視網膜有骨細胞樣色素沉著，視網膜血管變細，視盤顏色變淡(圖2)；全視野ERG檢查結果顯示，暗適應a波和b波峰值降低；明適應a波和b波峰值重度降低；暗適應震蕩電位重度下降；明適應3 ERG a、b波均重度下降；明適應30 Hz閃爍ERG右眼振幅中度下降，左眼振幅輕度下降(圖3)。家系成員患者的共同表現(xiàn)為7～10歲開始出現(xiàn)夜盲，約50歲時周邊視力完全喪失。

2.2 靶向基因高通量測序

該家系檢測到RHO基因(NM_000539.3)5號外顯子中的1個雜合錯義變異c.982delC(p.L328fs)。經Mutation taster軟件預測，該變異導致編碼序列第328位氨基酸處的亮氨酸缺失并發(fā)生移碼，改變了包括第328位氨基酸以后的21個氨基酸，造成終止密碼子改變，使編碼區(qū)由348個氨基酸增加到358個氨基酸，預測變異可導致蛋白結構發(fā)生改變(圖4)。

2.3 RHO基因c.982delC變異Sanger測序驗證及致病性分析

臨床診斷為RP的患者(Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅲ3、Ⅲ5、Ⅲ8、Ⅳ1、Ⅳ2和Ⅳ5)均檢測到了c.982delC變異，無癥狀成員未檢測到該位點變異。RHO基因編碼RHO蛋白的多個同源序列比對分析表明，6個不同物種之間第328位亮氨酸殘基(p.L328)均保守(圖5)。根據ACMG遺傳變異分類標準與指南判斷：(1)缺失移碼變異屬于非常強的致病性證據(PVS1)；(2)該變異在ExAC和千人基因組數(shù)據庫中均未被收錄，屬于中等致病性證據(PM2)；(3)HGMD(CM973326)和Retina International數(shù)據庫(http://www.retina-international.org)曾報告RHO基因編碼第328氨基酸的堿基錯義致病變異，其中Leu(密碼子：GAG)被Pro取代，屬于中等致病性證據(PM5)；(4)家系多個患者中檢測到此變異，變異與疾病在家系中共分離，屬于支持致病性證據(PP1)；(5)Mutation taster軟件預測該缺失移碼變異偏向致病性，屬于支持致病性證據(PP3)；(6)家系患病成員臨床表型符合RP，屬于支持致病性證據(PP4)。綜上，該變異具有1個非常強的致病性證據PVS1，2個中等致病證據PM2，3個支持致病證據PP1、PP3、PP4，屬于致病性變異。

3 討論

RP是常見的眼科遺傳病，在已發(fā)現(xiàn)的96個致病基因中，有30個基因表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，基因檢測是對ADRP進行分子診斷的重要依據。二代測序技術是目前臨床上用于檢測基因變異的一種可行、省時的方法[8]。本研究采用引物包靶向擴增高通量測序的方法，與全外顯子測序相比，本方法適用于單種疾病，有較高的性價比，分析有針對性，且操作快捷、簡單。對于涉及幾十種基因的RP，靶向包測序的方法更加適用。

本研究在該家系中檢測到了RHO基因c.982delC雜合變異。RHO基因編碼含有348個氨基酸的RHO蛋白，RHO是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員之一，RHO蛋白C端第310～349位氨基酸可與11-順-視黃醛形成功能性發(fā)色。當光子照射到RHO時，11-順-視黃醛異構化，在視桿細胞中啟動光轉導級聯(lián)反應[9]，在將光能轉換為電能的光轉導過程中起著關鍵作用。C端變異影響RHO在高爾基體的轉運，并損害光感受器外段的正常功能[10]。RHO蛋白C端的重要靶向序列VXPX-COOH也控制著視桿細胞外段的感光功能，其基序VXPX的缺失會導致RP[11-12]。該家系中RHO基因的c.982delC移碼變異改變了高度保守的氨基酸殘基328～349區(qū)域，其中包括VXPX基序，該變異很可能通過破壞RHO蛋白的正常光轉導功能而致病。

RHO錯義變異是RP中較常見的變異類型，在中國人群中RHO變異占所有RP病例的1.30%～5.65%，占ADRP的8.11%～15.00%[13]，而在高加索人群中，RHO變異占ADRP的16%～26%。在一項對200名西班牙RP先證者的研究中發(fā)現(xiàn)，27個RHO變異中有25個是錯義變異[14]。在另外一項涉及中國248名RP先證者的研究中，檢出的錯義變異占RHO變異的87.5%(7/8)[15]。HGMD和Retina International數(shù)據庫曾收錄RHO基因編碼第328位氨基酸的堿基錯義變異，其中Leu(密碼子：GAG)被Pro取代。截至目前，RHO基因的c.982delC(p.L328fs)移碼變異未在大的家系中被報道。Sullivan等[16]在散發(fā)病例中檢測到該變異，但未對該變異的致病性進行詳細說明。另一項研究試圖用高通量細胞學方法來篩選RHO在細胞中的表達以分析該變異的致病性，但并未得到確切的結果[17]。本研究為首次在中國漢族RP家系中對該變異進行驗證。

RHO變異導致的RP有一定的基因型和表型的相關性。RHO中的錯義變異與象限型RP相關[18]。RHO蛋白COOH末端序列的變異與早發(fā)性侵襲性RP相關[19]。本研究中RP家系的臨床表現(xiàn)與之前報道的相似，即患者青少年時期即出現(xiàn)夜盲，在50多歲時出現(xiàn)嚴重視力損害，包括中心視力喪失。本家系患病成員雖然攜帶有相同的致病突變位點，但由于個體差異，臨床表現(xiàn)也不盡相同，如視力、視野等。先證者的主要目的是進行遺傳咨詢，我們?yōu)樵撓茸C者找到了高度可疑的致病突變。以此為基礎，本課題組正在構建小鼠動物模型，以進一步探索該突變的致病機制。

綜上所述，本研究通過對中國漢族ADRP一家系的研究證實了RHO基因c.982delC雜合變異的致病性，該突變在中國漢族家系中首次報道。本研究為指導該家系成員的優(yōu)生優(yōu)育提供了分子診斷依據，并且該發(fā)現(xiàn)豐富了RP致病突變數(shù)據庫信息，為深入研究RP的致病機制提供了新的線索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突