何歡歡 高蓉蓉 王勤美 黃錦海

傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率由于受衍射極限和光源的限制已達(dá)到極限。1961年，F(xiàn)ranken等首次觀察到了激光倍頻現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)將激光器波長(zhǎng)調(diào)制為694.3 nm的紅外激光（基波）照射石英晶體時(shí)，有2束激光從晶體中穿出，一束為紅外激光，另一束為激光與晶體發(fā)生相互作用產(chǎn)生的波長(zhǎng)為347.15 nm的紫外激光，紫外激光的頻率為基波的2倍，波長(zhǎng)為基波的1/2，稱之為二次諧波（Second harmonic generation，SHG）現(xiàn)象，根據(jù)光波與介質(zhì)相互作用產(chǎn)生的非線性光學(xué)效應(yīng)可對(duì)生物體進(jìn)行成像和探測(cè)。從此，SHG的研究進(jìn)展迅速，在肌腱、血管和眼部組織得到了應(yīng)用[1]?，F(xiàn)筆者簡(jiǎn)述SHG的產(chǎn)生原理、成像特點(diǎn)及其眼科應(yīng)用。

1 SHG成像的原理和特點(diǎn)

波長(zhǎng)為λ、頻率為ν的入射光作用在介質(zhì)上時(shí)使介質(zhì)從基態(tài)激發(fā)為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)回落到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生1個(gè)波長(zhǎng)為1/2 λ、頻率為2 ν的光波，即SHG。SHG成像源于激光與不同介質(zhì)的非線性相互作用，信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的光場(chǎng)強(qiáng)度和介質(zhì)本身性質(zhì)有關(guān)，所以通過(guò)控制激發(fā)光光場(chǎng)強(qiáng)度和探測(cè)SHG信號(hào)強(qiáng)度即可得知介質(zhì)的電子態(tài)、排列方式和旋向等微觀結(jié)構(gòu)[1]。

SHG信號(hào)的產(chǎn)生需同時(shí)滿足以下2個(gè)條件：①介質(zhì)為非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)：角膜基質(zhì)中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維、鞏膜中致密的膠原纖維[2，3]以及篩板（Laminacribrosa，LC）和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Retinal ganglion cell，RGC）軸突中的微管（Microtubule，MT）[4]均為高度非中心對(duì)稱，所以可以產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)；②相位匹配條件：傳播中的倍頻光波和新激發(fā)出的SHG保持相位上的一致性才能產(chǎn)生信號(hào)。

SHG信號(hào)是生物組織產(chǎn)生的原發(fā)信號(hào)，無(wú)需加分子探針即可得到信號(hào)值，信號(hào)強(qiáng)度的影響因素包括：①介質(zhì)種類：同一光源照射角膜膠原纖維和肌腱膠原纖維所得的信號(hào)強(qiáng)度不同；②膠原纖維的類型：Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原纖維的SHG信號(hào)強(qiáng)度各不相同；③激發(fā)光偏振方向、光線與膠原纖維形成角度以及成像深度。

SHG顯微成像裝置主要包括激光發(fā)射器、物鏡、濾光片組和信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)。在眼科成像中通常選用775～860 nm 的激發(fā)光源，在保證產(chǎn)生較強(qiáng)信號(hào)的同時(shí)避免樣品受損。信號(hào)收集方式分為前向和背向探測(cè)，前向成像較清晰地顯示了單個(gè)膠原纖維的形狀和方向，背向成像雖較模糊但能顯示膠原纖維片層的分布。臨床上實(shí)時(shí)觀測(cè)活體角膜需采用背向信號(hào)，無(wú)法采集前向成像。因?yàn)镾HG和雙光子熒光（Two-photon excited fluorescence，TPEF）都是二階非線性現(xiàn)象且空間分辨率相當(dāng)，成像系統(tǒng)兼容，所以已商品化的TPEF顯微鏡只需要更換濾光片即可用于實(shí)現(xiàn)尚未商品化的背向SHG成像。

SHG成像與傳統(tǒng)光學(xué)成像技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)[1]：①近紅外激發(fā)光源減少了樣品的光損傷，而且發(fā)生非線性效應(yīng)，光線不被吸收，減少了熱損傷；②樣本的制備無(wú)需固定、切片和染色，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，避免破壞樣本形態(tài)和染料的光毒性；③SHG一般只發(fā)生在焦點(diǎn)附近的極小區(qū)域，對(duì)周圍樣品損傷大大減少，無(wú)需使用共焦小孔即可獲得三維圖像；④分辨率高，具有較高的信噪比，允許在組織的不同深度進(jìn)行成像，成像深度優(yōu)于常規(guī)技術(shù)。

2 SHG成像與其他成像技術(shù)的結(jié)合

目前對(duì)SHG信號(hào)了解不夠深入，因此通常還需要與TPEF顯微鏡和共聚焦成像等其他方式結(jié)合使用，獲得信息互為補(bǔ)充。

2.1 SHG與光學(xué)相干斷層掃描（OCT）的結(jié)合

SHG成像基于組織的非線性光學(xué)特性，而OCT則基于組織的線性光學(xué)散射特性（折射率）。OCT軸向分辨率高、敏感度高、探測(cè)速度快且無(wú)創(chuàng)，在眼前節(jié)和眼底成像方面已得到廣泛應(yīng)用，在SHG成像中引入OCT，可以提高探測(cè)的靈敏度，增加成像深度。但是OCT不能消除焦點(diǎn)以外的雜散光，限制其成像分辨率，SHG在成像質(zhì)量和光損方面有了明顯提高，且側(cè)重于纖維排列，在OCT中引入SHG成像可以發(fā)現(xiàn)組織更早期的變化，有利于早期診斷。隨著光纖技術(shù)的高度發(fā)展，SHG-OCT技術(shù)可與光纖光學(xué)結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)活體的內(nèi)窺鏡檢查。

2.2 SHG與TPEF的結(jié)合

SHG是非線性散射，與樣品的二階非線性極化率的空間分布有關(guān)，主要呈現(xiàn)膠原纖維；TPEF則是基于熒光發(fā)射后的非線性吸收成像，可發(fā)射波長(zhǎng)為750～826 nm的激發(fā)光，通過(guò)對(duì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和黃酮類腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）的激發(fā)來(lái)顯像細(xì)胞結(jié)構(gòu)[5]。SHG成像和TPEF成像的聯(lián)合使用，無(wú)需任何染料即可顯示整個(gè)角鞏膜的纖維和細(xì)胞[6-8]以及視網(wǎng)膜的多種細(xì)胞[9]。

3 SHG在眼科中的應(yīng)用

SHG成像技術(shù)可以直觀評(píng)估眼部的角膜基質(zhì)、小梁網(wǎng)、鞏膜、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突中的微管等結(jié)構(gòu)，在相關(guān)眼病的診治中已有研究應(yīng)用。

3.1 角膜基質(zhì)的SHG成像

基質(zhì)層占角膜全層的90%，由少量的角膜基質(zhì)細(xì)胞和大量的膠原纖維構(gòu)成，膠原纖維呈非中心對(duì)稱柱狀結(jié)構(gòu)，在強(qiáng)激光激發(fā)下可以產(chǎn)生SHG強(qiáng)信號(hào)。Bowman層膠原纖維短且排列方向不規(guī)則，前向成像呈明顯的點(diǎn)狀信號(hào)，背向成像呈模糊和漫反射的信號(hào)，板層間分支和吻合很多，Bowman層的弧形纖維和錨定纖維有助于固定膠原板層；在前基質(zhì)層，膠原纖維變寬變長(zhǎng)，排列方向更一致但仍隨機(jī)分布，板層間分支和吻合減少，前向成像呈隨機(jī)排列的短纖維束，背向成像呈明顯交織的薄片；后基質(zhì)層的膠原束隨深度增加變得更長(zhǎng)、更寬，方向更規(guī)律，分支和吻合進(jìn)一步減少[10，11]。

3.2 圓錐角膜的SHG成像

SHG可以觀察到圓錐角膜患者的中央和旁中央角膜變薄、變陡，插入Bowman層的弓形纖維和錨定纖維減少，Bowman層和膠原纖維斷裂，纖維板層分支和吻合明顯減 少[12-15]。角膜膠原交聯(lián)術(shù)后，SHG還可以觀察角膜膠原纖維的主要排列方向，從而評(píng)估交聯(lián)效果[16]，在角膜基質(zhì)前1/3最顯著，且效果在一定范圍內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加[17-19]。

3.3 角膜屈光手術(shù)術(shù)后的SHG成像

角膜屈光手術(shù)后，SHG可以清楚觀察到角膜的切削邊界和膠原纖維的形態(tài)變化，評(píng)估手術(shù)效果和監(jiān)測(cè)角膜擴(kuò)張等并發(fā)癥的出現(xiàn)。Kivanany等[20]使用SHG和TPEF聯(lián)合檢測(cè)了板層角膜切削（Lamellar keratectomy，LK）術(shù)后細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的改變，觀察到術(shù)后角膜細(xì)胞的遷移、纖維化、重塑和再生的全過(guò)程：術(shù)后在切削平面下發(fā)生角膜基質(zhì)細(xì)胞的死亡；術(shù)后第7 和第21 天成纖維細(xì)胞與膠原板層共同排列，成纖維細(xì)胞的移動(dòng)受膠原板層調(diào)控，同時(shí)基質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；術(shù)后60 d，細(xì)胞和基質(zhì)形成板層結(jié)構(gòu)。

3.4 角膜感染的SHG成像

Robertson等[21]使用SHG成像和多光子熒光顯微鏡定量研究了離體和在體兔角膜感染期間，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）侵入角膜基質(zhì)中的定向運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)PA的運(yùn)動(dòng)方向和膠原纖維的排列方向明顯相關(guān)，感染多發(fā)生在膠原纖維排列方向更一致的角膜中央，PA順著膠原纖維的走形在纖維間隙通行導(dǎo)致感染擴(kuò)散，而角膜緣區(qū)和鞏膜區(qū)的膠原纖維分布雜亂，感染不常見(jiàn)。PA浸潤(rùn)最密集的地方引起膠原纖維壞死，背向SHG只能檢測(cè)到極小的信號(hào)。SHG成像顯示膠原纖維，多光子熒光顯微鏡顯示PA，二者結(jié)合可以獲知PA的感染路徑和對(duì)膠原纖維的破壞程度，有望成為評(píng)估角膜微生物感染的的工具[22]。

3.5 網(wǎng)格狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良（Lattice corneal dystrophy，LCD）的SHG成像

LCD是淀粉樣變性病的典型類型。淀粉樣蛋白肽的SHG信號(hào)等于甚至高于內(nèi)源性膠原纖維的信號(hào)，可用作生物成像的SHG探針[23]。超短淀粉樣蛋白肽是長(zhǎng)度為微米級(jí)、直徑僅7～10 nm的螺旋纖維，形態(tài)與膠原纖維相似。SHG顯微鏡提供了簡(jiǎn)單且無(wú)標(biāo)記的方法來(lái)檢測(cè)淀粉樣蛋白肽，定量分析其取向、形態(tài)和亞微米異質(zhì)性，可用于體內(nèi)診斷LCD等角膜疾病。與常規(guī)熒光成像技術(shù)相比，SHG光學(xué)穿透力更深、光損傷更低和觀察時(shí)間更長(zhǎng)。

3.6 房水流出通道的SHG成像

小梁網(wǎng)是房水流出的主要路徑，SHG可以檢測(cè)小梁網(wǎng)中膠原纖維的分布，TPEF成像顯示小梁網(wǎng)的彈性纖維和代謝活性細(xì)胞，二者組合可提供生理狀態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵信息，具有明顯的對(duì)比度和特異性?？焖俑道锶~分析二次諧波成像（Fast fourier transform-second harmonic generation，F(xiàn)FT-SHG）成像利用2D 空間傅里葉分析，使用纖維取向、間距和厚度等參數(shù)來(lái)量化小梁網(wǎng)膠原纖維，還可對(duì)Schlemm管、虹膜和睫狀體的脈管系統(tǒng)進(jìn)行成像，更好地了解青光眼和角膜的生理病理學(xué)[24]。

3.7 鞏膜的SHG成像

鞏膜由致密且互相交織的膠原纖維和少量的彈性纖維構(gòu)成，前部與角膜相接，后部分為內(nèi)外兩層，外層移行為視神經(jīng)鞘膜，內(nèi)層呈網(wǎng)眼狀，RGC軸突由此穿出眼球。大部分膠原纖維都平行于鞏膜表面，SHG可對(duì)鞏膜中的膠原纖維進(jìn)行在體高分辨率的斷層掃描，揭示膠原束的分布和取向[25]。與角膜膠原纖維的板層排列不同，鞏膜膠原纖維呈束狀排列，且分布更密集無(wú)序。鞏膜膠原纖維的直徑和間隙與角膜基質(zhì)膠原纖維不同，背向SHG信號(hào)更強(qiáng)。由于鞏膜不透明，因此部分背向信號(hào)可能來(lái)自高度散布的鞏膜組織的前向信號(hào)的反向散射。Zyablitskaya等[3]利用SHG探測(cè)了羥基甲基甘氨酸鈉進(jìn)行鞏膜治療性組織交聯(lián)（Therapeutic tissue crosslinking，TXL）對(duì)高度近視眼的治療效果，觀察到TXL導(dǎo)致鞏膜膠原纖維束的SHG信號(hào)增強(qiáng)和波紋度減少，且具有濃度依賴性。

3.8 視乳頭（Optic nerve head，ONH）的SHG成像

在眼后極附近，LC和臨近的鞏膜組織即視乳頭周圍鞏膜（Periodicity plus smooth，PPS）共同形成了ONH的結(jié)締組織成分。LC是由復(fù)雜的、網(wǎng)狀陣列的束形成的，大部分束是圍繞毛細(xì)血管的富含膠原蛋白的結(jié)締組織鞘。LC區(qū)域的生物力學(xué)復(fù)雜，多孔LC的結(jié)締組織密度較低，在脆弱的RGC軸突周圍形成應(yīng)力集中區(qū)域，LC的機(jī)械變形引起RGC軸突損傷，可能是青光眼發(fā)生軸突損傷的最初部位，LC的機(jī)械特性在青光眼中起著重要作用[26]。LC很難通過(guò)傳統(tǒng)成像獲得，而SHG可以對(duì)LC的每個(gè)束進(jìn)行清晰成像[27]，基于二維離散傅里葉變換（Discrete fouriertransform，DFT）的方法，可以獲得束的排列方向的一致程度和分散程度。對(duì)整個(gè)LC進(jìn)行三維成像并與生物力學(xué)相結(jié)合，有助于闡明青光眼的發(fā)病機(jī)制[28]。PPS的最內(nèi)層表現(xiàn)出規(guī)整一致的徑向排列，中部則表現(xiàn)出圍繞ONH的膠原纖維的強(qiáng)圓周取向。PPS的膠原纖維結(jié)構(gòu)是決定眼內(nèi)壓引起ONH變形的重要因素。通過(guò)SHG和小角度光散射（Small-angle light scattering，SALS）對(duì)橫向和縱向人類ONH冷凍切片進(jìn)行成像，量化首選纖維方向（Preferred fibre orientation，PFO）和纖維排列的程度（Degree of fibre alignment，DOFA），發(fā)現(xiàn)DOFA在PPS中最高，在LC中相對(duì)較低。老年人PPS的DOFA高于年輕人，正常人通常高于青光眼患者[29]。在所有LC中，大多數(shù)纖維在整個(gè)鼻－顳方向具有優(yōu)先取向。青光眼LC中的大部分PFO與對(duì)照組存在明顯差異，且下顳葉LC纖維排列取向更一致。LC內(nèi)纖維排列的差異可能是青光眼視神經(jīng)病變所特有的，可能是ONH重塑和（或）塌陷的結(jié)果。

3.9 MT的SHG成像

RGC的凋亡以及軸突逐漸丟失是青光眼的典型特征。RGC軸突中的MT為非中心對(duì)稱分子結(jié)構(gòu)且均勻極化，完整的MT骨架結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生強(qiáng)SHG信號(hào)，量化RGC活性[30]。微管的二次諧波成像無(wú)需使用外源性染色劑或基因工程即可顯示視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維束，有益于探索青光眼的發(fā)病機(jī)制。DBA/2J小鼠模型的SHG成像發(fā)現(xiàn)MT破壞可引起SHG密度的衰減，且比MT厚度的衰減率高約97%，表明MT的破壞早于RGC軸突的喪失和纖維束形態(tài)或厚度的改變，為“MT青光眼假說(shuō)”提供了支持[4]。SHG密度的降低使RGC軸突更易受到眼內(nèi)壓升高的影響，可敏感地檢測(cè)軸突損傷，且SHG信號(hào)強(qiáng)度對(duì)MT裝配的規(guī)律性高度敏感，故還可探測(cè)整個(gè)RNFL上不穩(wěn)定的細(xì)胞骨架元件的結(jié)構(gòu)完整性，可在RNFL變薄之前靈敏地發(fā)現(xiàn)青光眼的早期病變[31]。

4 總結(jié)和展望

SHG可用于獲取離體組織和在體組織的成像。目前只有背向SHG可實(shí)現(xiàn)在體成像，但清晰度較差，限制了SHG技術(shù)的應(yīng)用。隨著SHG的發(fā)展和與其他成像技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，SHG有望成為角膜擴(kuò)張性疾病和角膜感染的臨床檢測(cè)手段，并用于角膜交聯(lián)和屈光手術(shù)術(shù)后評(píng)估療效和并發(fā)癥的檢查；在鞏膜和視網(wǎng)膜上，對(duì)LC和RGC的成像研究有助于青光眼和視神經(jīng)損害等疾病的發(fā)病機(jī)制的探索和治療的評(píng)估，在疾病的早期診斷方面具有廣闊應(yīng)用前景。

利益沖突申明本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明何歡歡：收集文獻(xiàn)資料、分析；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行文章修改。高蓉蓉、黃錦海：參與選題設(shè)計(jì)；指導(dǎo)資料的分析和解釋；對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱和修改。王勤美：對(duì)論文的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱