王 攀，左 琨，韓春明，鐘久昌，趙 蕾，董 瑩，張大鵬，李 晶

0 引 言

高血壓是心血管疾病和腦卒中的主要危險因素，全球每年約有940萬人因高血壓死亡[1]。血壓水平與心腦血管病發(fā)病和死亡風險存在密切的因果關系。在對全球 61個40～89 歲人群的前瞻性觀察研究中，發(fā)現(xiàn)診室血壓與腦卒中、冠心病事件、心血管病死亡的風險呈連續(xù)、獨立、直接的正相關關系[2]。血壓水平與心力衰竭發(fā)生也存在因果關系。臨床隨訪資料顯示，隨著血壓水平升高，心力衰竭發(fā)生率遞增[3]。長期高血壓-左心室肥厚-心力衰竭構(gòu)成一條重要的事件鏈。同時，高血壓也是心房顫動發(fā)生的重要原因[4]。因此，探究血壓大幅升高人群的疾病特征，對高血壓的早期預警早期診斷意義重大。

人體內(nèi)定植著超過100萬億的微生物[5]。腸道菌群參與機體的營養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生理過程[6]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的紊亂失調(diào)通過改變代謝產(chǎn)物、炎癥免疫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種途徑，參與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)[7]。研究者發(fā)現(xiàn)，如果血壓大幅升高，老年時大腦體積明顯縮小，且容易出現(xiàn)白質(zhì)病變[8]。然而，在血壓大幅上升的人群腸道微生物的結(jié)構(gòu)特征尚未見報道。本研究通過前瞻性隨訪研究，對基線時血壓大幅上升的人群的基線時期腸道菌群微生物進行前瞻性分析研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取河北省唐山開灤集團公司員工的隊列進行研究。以平均動脈壓(mean arterial pressure， MAP)為評價指標，隨訪2年(2014年5月-2016年5月)。血壓測量采用診室血壓，取3次診室血壓測量的平均值，每次間隔5 min。納入基線時期未應用降壓藥物首診的高血壓患者。最終納入MAP變化大于0 mmHg的研究個體，合計52例。將MAP上升的幅度≥10 mmHg患者納入上升組(33例)；將上升<10 mmHg患者納入對照組(19例)。排除癌癥、心力衰竭、腎功能衰竭、吸煙、卒中和外周動脈疾病，糖尿病或高膽固醇血癥的患者；以及采樣前8周內(nèi)服用過抗生素或益生菌的個體。所有研究對象均已簽署知情同意書。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(2018-科-18)。

1.2宏基因組測序本研究隊列樣本在前一項研究中已經(jīng)進行糞便樣本的DNA提取和宏基因組測序，原始測序數(shù)據(jù)已上傳至歐洲核甘酸檔案(ENA)數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB13870)[9]。本研究納入前一項研究的隊列中，共計52例樣本的宏基因組數(shù)據(jù)進行深入分析。

1.3腸道菌群生物多樣性指數(shù)計算α多樣性分析：通過分析屬級別和種級別的多樣性指數(shù)、豐富性指數(shù)和均一性指數(shù)判定腸道菌群的α多樣性特征。α多樣性指數(shù)應用QIIME (Version 1.7.0)計算； 豐富性指數(shù)和均一性指數(shù)應用R software (Version, 3.3.3)中vegan package計算。β多樣性分析用于評估樣品間細菌群落復雜性的差異，使用UniFrac軟件對樣品進行差異分析，包括UPGMA聚類樹分析、主成分分析、主坐標分析和非度量多維定標。

1.4腸型分析根據(jù)屬的相對豐度，采用Jensen-Shannon散度法和medoids法對各樣品的群落類型進行聚類。使用Calinski-Harabasz index16評估集群的最佳數(shù)量。設定平均相對豐度≥10-4且在≥6個樣本中出現(xiàn)的屬將進行最終分析。

本研究中，通過探究LVMAP和HVMAP兩組在基線時期的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異。采用PAM聚類劃分方法，根據(jù)菌屬的豐度確定腸型。根據(jù)Calinski-Harabasz (CH)索引，最佳腸型數(shù)為2種。利用JensenShannon距離進行主坐標分析。將樣本劃分為2種不同的腸型。擬桿菌Bacteroide為腸型1中含量最高的主導菌屬；普氏菌Prevotella為腸型2中含量最高的主導菌屬。

1.5厚壁菌門與擬桿菌門細菌比值計算對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行過濾處理以獲得有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)進行進行宏基因組組裝、物種注釋及豐度分析，進而計算各樣本中厚壁菌門與擬桿菌門細菌所占豐度。

1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行計算，非正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以M(P25，P75)表示，組間比較采Wilcoxon秩和檢驗。并用Benjamini和Hochberg方法校正P值進行多次檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 組間基線參數(shù)比較2組患者基線參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2患者腸道菌群生物多樣性的比較

2.2.1α多樣性本研究中α多樣性的研究結(jié)果表明，在生物多樣性方面，無論在屬級別或是種水平，兩組患者α多樣性指數(shù)(屬級別：2.72±0.43vs2.79±0.47；種級別：3.77±0.64vs3.88±0.50)，豐富性指數(shù)(屬級別：754.00±212.47vs695.00±148.24；種級別：2475.00±600.52vs2282.00±435.47)以及均一性指數(shù)(0.29±0.065vs0.282±0.07；種級別：0.49±0.07vs0.51±0.06)，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖 1。提示血壓大幅升高人群在基線時期的腸道菌群的α多樣性并無顯著性改變。

表 1 各組患者基線參數(shù)比較

圖 1 上升組與對照組患者基線腸道菌群α生物多樣性比較

2.2β多樣性在本研究中β多樣性分析結(jié)果顯示，在屬級別和種級別，2組樣本在非度量多維定標、主成分分析、主坐標分析的散點分布圖中，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖 2。表明血壓大幅升高人群在基線時期的腸道菌群β多樣性與對照組相似。

圖 2 上升組與對照組患者基線腸道菌群β生物多樣性比較

2.3腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在腸型分布的比較為探究2組患者基線時期的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異，進一步分析2組人群在擬桿菌和普氏菌代表的兩種不同腸型中的分布情況，見圖3。擬桿菌Bacteroide為腸型1中含量最高的主導菌屬；普氏菌Prevotella為腸型2中含量最高的主導菌屬(P1=3.32e-08，P2=1.61e-14)，見圖3。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HVMAP組患者更多分布于Bacteroide腸型，而LVMAP組樣本更傾向于分布在Prevotella。2組人群在Bacteroide腸型的比例分別為43.3%和56.7%。在Prevotella腸型的比例分別為56.7%和43.3% ，見圖3。

2.4厚壁菌門/擬桿菌門比例2組人群中物種相對豐度差異無統(tǒng)計學意義(0.53±0.39vs0.61±0.52，P=0.72)，見圖3。結(jié)果表明，血壓大幅升高人群在基線時期的腸道菌群厚壁菌門/擬桿菌門比例尚無顯著性改變。

圖 3 上升組與對照組患者基線腸道微生物群落腸型與比較

3 討 論

高血壓是心血管疾病最常見的可改變的危險因素。2015年的一項研究表明，腸道菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)與高血壓之間具有直接的相互關聯(lián)性[11]。高血壓相關的腸道菌群穩(wěn)態(tài)的失調(diào)主要表現(xiàn)為，厚壁菌門與擬桿菌門比例升高，腸道微生物的豐富性顯著降低；產(chǎn)生醋酸鹽、丁酸鹽的腸道細菌顯著減少，而產(chǎn)生乳酸鹽的細菌顯著增加。本團隊前期研究結(jié)果表明，在高血壓前期和高血壓人群中，微生物豐富度和多樣性顯著降低，與健康狀態(tài)相關的細菌減少，普氏菌和克雷伯菌過度生長[10]。此外，高血壓前期組的微生物群特征與高血壓組非常相似。近年來，越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群的紊亂失調(diào)與高血壓之間甚至存在著因果關系，腸道微生物參與了高血壓疾病的發(fā)生和發(fā)展[12]。一項研究中，與常規(guī)小鼠相比，無菌小鼠對AngII的升壓反應減弱，表明腸道菌群介導了血管緊張素誘發(fā)的血壓升高[13]。高血壓能夠塑造宿主腸道菌群，而改變腸道微生物同時也具有調(diào)節(jié)血壓的作用。

因此，本研究在前期研究的基礎上，通過前瞻性的研究，隨訪隊列人群2年后的血壓變化，對比MAP大幅上升患者與對照組在基線時的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征，試圖分析腸道菌群結(jié)構(gòu)變化特征對平均動脈壓大幅上升患者的預測價值，探索潛在的促進血壓進行性升高的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征，為高血壓的防治提供新的策略和思路。本研究分別納入MAP上升≥10 mmHg及<10 mmHg的患者，分析其血壓變化前的基線時期，腸道菌群的生物多樣性及腸型特點。結(jié)果顯示，兩組并差異無統(tǒng)計學意義。說明基線時MAP大幅上升人群的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征與對照組相似，提示腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的紊亂失調(diào)的程度對平均動脈壓大幅上升的預測價值有限。

既往多項研究表明，研究者認為腸道微生物在多種疾病中具有預測和早期診斷疾病的潛力。梭桿菌，脆弱擬桿菌和腸致病性大腸桿菌均是結(jié)直腸癌的致癌菌，作為生物標志物時具有預測價值[14]。這些研究表明，腸道微生物組可作為結(jié)直腸癌早期篩查的有效工具[15-16]。另外，橋本甲狀腺炎患者腸道菌群發(fā)生改變，且腸道菌群與臨床參數(shù)相關，提示腸道菌群組成數(shù)據(jù)可用于疾病診斷[17]。此外，懷孕前和懷孕期間的微生物群調(diào)節(jié)和修飾可能為預防和治療減少超重和肥胖的風險提供新的方向[18]。但本研究中析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組患者在基線時期腸道菌群結(jié)構(gòu)特征十分類似，對未來宿主的血壓水平上升并不具有足夠的預測價值，也提示可能存在腸道菌群以外的其他生物學特征作為血壓上升的預測生物標志，仍待進一步研究和探索。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，基線時平均動脈壓大幅上升人群的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征與對照組相似，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的紊亂失調(diào)的程度對平均動脈壓大幅上升的預測價值有限。