張旭飛，吳秀文綜述，任建安審校

0 引 言

病原微生物感染宿主釋放的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和細(xì)胞損傷釋放的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)一直是固有免疫研究中的熱點(diǎn)[1-2]。模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)是固有免疫中不可或缺的成分，可識(shí)別PAMPs和DAMPs，激活固有免疫，誘導(dǎo)炎癥因子或趨化因子的分泌，故PRRs在監(jiān)測(cè)病原微生物的入侵和組織細(xì)胞的損傷中起到關(guān)鍵作用[3]。早期的研究已對(duì)細(xì)胞表面的PRRs進(jìn)行了詳細(xì)闡述。然而，近年來(lái)細(xì)胞內(nèi)PRRs在病原微生物識(shí)別系統(tǒng)中的作用越來(lái)越受到重視。

鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)、干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)均是細(xì)胞內(nèi)PRRs。cGAS可識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)，激活狀態(tài)的cGAS可將三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和三磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine triphosphate，GTP)合成2′3′-環(huán)化鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP，cGAMP)。2′3′-cGAMP可直接激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING蛋白，STING激活后由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體上轉(zhuǎn)移[4]。激活的STING在高爾基體上招募并激活TANK結(jié)合激酶1 (TANK binding kinase 1，TBK-1)。一方面，TBK-1可直接激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生；另一方面，TBK-1招募并磷酸化下游干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)，磷酸化的IRF3可入核啟動(dòng)干擾素相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)Ⅰ型干擾素的合成，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)[5]，見(jiàn)圖1。此外，cGAS-STING通路還參與調(diào)控細(xì)胞代謝、自噬、死亡，在腸道炎癥、非酒精性脂肪肝、胰腺、腎纖維化等損傷中發(fā)揮著作用[6]。故調(diào)控cGAS-STING通路對(duì)于組織細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持、相關(guān)疾病的治療具有重要意義。本文針對(duì)cGAS-STING通路中各環(huán)節(jié)的干預(yù)機(jī)制及相關(guān)藥物作一綜述。

圖 1 STING通路及其調(diào)控機(jī)制和藥物

1 cGAS的調(diào)控

cGAS是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)dsDNA的感受器，cGAS與dsDNA結(jié)合后，cGAS催化位點(diǎn)的構(gòu)象由無(wú)序變?yōu)橛行?。最新的研究發(fā)現(xiàn)，cGAS激活后會(huì)形成二聚體，cGAS二聚體與外側(cè)兩條dsDNA形成梯形結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)后續(xù)cGAS二聚體與兩條dsDNA結(jié)合，dsDNA的鏈越長(zhǎng)，結(jié)合的cGAS二聚體則越多，故cGAS的激活數(shù)量是取決于dsDNA的長(zhǎng)度[7]。我們發(fā)現(xiàn)，給予盲腸結(jié)扎穿孔的小鼠腹腔注射脫氧核糖核酸酶Ⅰ，會(huì)明顯減少造模小鼠血循環(huán)線粒體DNA和炎癥因子含量，改善膿毒癥介導(dǎo)的腸道損傷[8]。此外，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)或高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)參與裝配cGAS-dsDNA形成的梯形結(jié)構(gòu)，促進(jìn)cGAS的激活[7]。所以促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)dsDNA的降解，減少細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TFAM、HMGB1的釋放可從根本上抑制cGAS-STING通路的始動(dòng)環(huán)節(jié)。

1.1cGAS的抑制劑Hall等[9]發(fā)現(xiàn)一種具有生物活性的小分子PF-06928215可抑制cGAS活性，并且這種試劑本身對(duì)細(xì)胞活性影響很小。深入研究發(fā)現(xiàn)，PF-06928215可結(jié)合于cGAS的活性位點(diǎn)，這種結(jié)合可能會(huì)影響ATP與cGAS的結(jié)合以及下游cGAMP的合成。既往已發(fā)現(xiàn)羥化氯喹、奎納克林等抗瘧疾藥物具有抑制cGAMP合成的作用，但深入研究發(fā)現(xiàn)這些藥物作用機(jī)制并不是與cGAS活性位點(diǎn)結(jié)合，而是與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)DNA結(jié)合，從而阻止了DNA與cGAS的結(jié)合[10]。據(jù)此，An等[11]設(shè)計(jì)、合成了一種類抗瘧疾藥物，命名為“X6”，能夠阻止DNA與cGAS的結(jié)合，并且X6對(duì)cGAS-STING通路的抑制作用要強(qiáng)于羥化氯喹。suramin是WHO推薦治療河盲癥和非洲昏睡病藥物清單上的基本藥物。最近，Sintim團(tuán)隊(duì)通過(guò)篩選分析發(fā)現(xiàn)suramin是潛在的cGAS抑制劑，其作用機(jī)制較為獨(dú)特，能夠?qū)sDNA從cGAS解離下來(lái)，減少cGAMP的生成，緩解cGAS-STING通路的激活，降低Ⅰ型干擾素的合成[12]。

1.2cGAS的轉(zhuǎn)錄后修飾cGAS轉(zhuǎn)錄后修飾可調(diào)控cGAS的活性。2015年，Seo等[13]發(fā)現(xiàn)Akt激酶可通過(guò)磷酸化cGAS的Ser291或Ser305位點(diǎn)抑制cGAS的酶活性，給予Akt1/2特異性抑制劑Ⅷ或突變?cè)摿姿峄稽c(diǎn)可促進(jìn)dsDNA誘導(dǎo)的干擾素合成釋放。此外，cGAS的泛素化修飾亦可調(diào)控cGAS的活性。RNF185是一種E3泛素化連接酶，在單純皰疹病毒-1感染細(xì)胞期間，RNF185可于cGAS的K173和K384位點(diǎn)上介導(dǎo)K27泛素鏈形成，促進(jìn)cGAS的酶活性；而沉默RNF185可抑制cGAS的酶活性，限制干擾素應(yīng)答效應(yīng)[14]。TRIM56也是一種E3泛素化連接酶，早期研究認(rèn)為T(mén)RIM56是通過(guò)泛素化STING蛋白促進(jìn)STING通路激活，然而后期發(fā)現(xiàn)TRIM56的敲除并不影響cGAMP直接激活STING。有研究深入探索，發(fā)現(xiàn)TRIM56是通過(guò)介導(dǎo)cGAS的K335位點(diǎn)泛素化，促進(jìn)cGAS二聚化以及cGAMP的產(chǎn)生，加強(qiáng)cGAS-STING通路[15]。盡管如此，cGAS的活性是否受泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的其他成分動(dòng)態(tài)調(diào)控仍是一個(gè)有待解決的問(wèn)題。

2 STING的激動(dòng)劑和抑制劑

STING是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白。在人STING蛋白結(jié)構(gòu)中，其N末端有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，C末端是TBK1/IRF3連接結(jié)構(gòu)域，此外還有一段CDNs連接結(jié)構(gòu)域[16]。雖然STING激活后通過(guò)NF-κB、IRF3通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，損傷組織器官，但這種免疫應(yīng)答亦可介導(dǎo)免疫防御，抵抗病原微生物感染，或監(jiān)測(cè)腫瘤來(lái)源的dsDNA，產(chǎn)生固有的抗腫瘤免疫。除了經(jīng)典通路，STING也有許多非經(jīng)典通路。最新的研究發(fā)現(xiàn)，STING被激活后，其TM5、TM2結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)招募并激活NLRP3炎性小體，促進(jìn)抗病毒反應(yīng)[17]。

2.1STING的核苷酸類激動(dòng)劑環(huán)化二核苷酸(cyclic dinucleotides，CDNs)是STING的直接激動(dòng)劑。在經(jīng)典通路中，cGAS產(chǎn)生的是2′3′-cGAMP，2′3′-cGAMP也是CDNs的一種。而在細(xì)菌感染宿主細(xì)胞過(guò)程中，會(huì)釋放其他種類的CDNs，如2′2′-cGAMP、3′3′-cGAMP、c-diAMP以及c-diGMP[5]。這些環(huán)化二核苷酸可直接激活STING，誘導(dǎo)STING相關(guān)免疫應(yīng)答。盡管CDNs種類眾多，但既往研究發(fā)現(xiàn)cGAMP激活STING誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的能力高于c-diAMP和c-diGMP[18-19]；但在cGAMP中，2′3′-cGAMP結(jié)合STING的能力更強(qiáng)，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的能力也更強(qiáng)[18-19]。為對(duì)抗STING的激活，細(xì)胞內(nèi)存在水解2′3′-cGAMP的固有機(jī)制。核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1)是一種跨膜糖蛋白，位于細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，在人體中廣泛表達(dá)，包括胃腸道、肺、肝、脂肪組織等。研究發(fā)現(xiàn)ENPP1可將細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)2′3′-cGAMP水解成AMP和GMP，從而抑制2′3′-cGAMP激活STING[20]。此外，ENPP1的催化結(jié)構(gòu)域中含兩個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，并且鋅離子與ENPP1的水解活性密切相關(guān)[21]。

盡管CDNs是STING的直接激動(dòng)劑，但單純的CDNs實(shí)際利用起來(lái)有諸多缺點(diǎn)，如：穩(wěn)定性差、細(xì)胞膜穿透性較差等。鑒于此，許多研究致力于CDNs的修飾，從而改善CDNs的性能。CDNs修飾的方法有很多，如為對(duì)抗磷酸酶可進(jìn)行硫代磷酸化修飾、為增加膜穿透性可進(jìn)行脂肪酸/氟修飾、為改善與STING的結(jié)合能力可進(jìn)行核苷酸替換等，修飾的位點(diǎn)常在于磷酸二酯鍵的部位以及2′3′-OH部位[22-24]。盡管修飾可改善CDNs部分性能，但也可能會(huì)影響CDNs對(duì)STING的激活能力。

2.2STING的非核苷酸類激動(dòng)劑為克服CDNs的缺點(diǎn)，也為適合工業(yè)化生產(chǎn)和低成本保存的需求，許多團(tuán)隊(duì)試圖尋找取代CDNs的分子。當(dāng)前，主要有6種STING的非核苷酸類激動(dòng)劑：5,6-二甲基黃體酮-4-乙酸(5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA)、黃酮乙酸(flavone acetic acid，F(xiàn)AA)、10-羧甲基-9-吖啶酮(10-carboxymethyl-9-acridanone，CMA)、α-倒捻子素(α-Mangostin)、BNBC以及[25-30]。在以上6種分子中，并不是全部都對(duì)人類STING蛋白有效，只有α-倒捻子素、BNBC、diABZ能夠激活人類STING蛋白；此外，只有BNBC對(duì)鼠STING無(wú)效，其余5種都對(duì)鼠STING有效。

DMXAA和FAA是黃酮類化合物，它們被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)破壞腫瘤血管系統(tǒng)和誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌來(lái)抑制小鼠模型下的黑素瘤、膠質(zhì)瘤以及非小細(xì)胞肺癌[26,31-32]。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)α-倒捻子素對(duì)人類STING的激活能力要強(qiáng)于鼠STING。此外，α-倒捻子素干預(yù)后，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)變，而M1型巨噬細(xì)胞可參與抗腫瘤免疫[29]。Ramanjulu等[25]通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)diABZI能夠與cGAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于STING上，并且diABZI與STING的結(jié)合親合力是2′3′-cGAMP的18倍，同時(shí)diABZI激活STING誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的效果亦強(qiáng)于2′3′-cGAMP。改良后的diABZI在靜脈注射后對(duì)CT26結(jié)直腸腫瘤有顯著的抑制作用作用[25]。盡管上述6種STING激動(dòng)劑相比于CDNs，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性、適合商業(yè)化生產(chǎn)，但細(xì)胞膜穿透性仍較差。

2.3STING的抑制劑近年來(lái)，關(guān)于STING抑制劑的研究主要圍繞STING的棕櫚?；?。在2016年，Mukai等[33]發(fā)現(xiàn)STING激活后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體上，并在高爾基體上發(fā)生棕櫚?；?，其棕櫚酰化位點(diǎn)是位于STING半胱氨酸88/91上。STING發(fā)生棕櫚酰后，能夠促進(jìn)STING的二聚化形成，招募下游TBK1。故STING的棕櫚?；揎棇?duì)于STING下游的激活至關(guān)重要。2018年，Haag等[34]通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)兩種硝基呋喃衍生物(C-176、 C-178)能夠明顯抑制干擾素的應(yīng)答，其機(jī)制是抑制STING半胱氨酸91位點(diǎn)的棕櫚?；?；但C-176、 C-178只能抑制鼠STING，對(duì)人STING無(wú)效。研究者又根據(jù)C-176、C-178結(jié)構(gòu)，得到另兩種衍生物——C-170、C-171。C-170和C-171亦可抑制STING半胱氨酸91位點(diǎn)的棕櫚?；⑶褻-170和C-171可同時(shí)抑制人STING和鼠STING。此外，研究者也篩選出另一種衍生物H-151，通過(guò)同樣機(jī)制負(fù)調(diào)控人STING和鼠STING。同年，Hansen等[35]發(fā)現(xiàn)3種硝基脂肪酸——硝基共軛亞油酸、9-硝基油酸和10-NO2-OA，這3種硝基脂肪酸可抑制STING半胱氨酸88/91位點(diǎn)的棕櫚?；瑫r(shí)抑制人STING和鼠STING。

STING也存在一些競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。2018年，Li等[36]從環(huán)肽數(shù)據(jù)庫(kù)里篩選出了能抑制cGAS-STING通路的Astin C，其為從藥用植物紫菀中提取的環(huán)肽。研究發(fā)現(xiàn)Astin C可結(jié)合于STING的C末端結(jié)構(gòu)域，從而抑制IRF3的招募[36]。并且給予Astin C可顯著緩解小鼠Trex1敲除所誘導(dǎo)的自發(fā)性炎癥反應(yīng)[36]。2019年，Siu等[37]通過(guò)自動(dòng)配體識(shí)別系統(tǒng)，篩選出Compound 18。Compound 18可連接STING結(jié)構(gòu)域上cGAMP結(jié)合的位點(diǎn)，抑制STING的激活；并且Compound 18具有較好的口服生物利用度。

2.4STING的轉(zhuǎn)錄后修飾2013年，Konno等[38]發(fā)現(xiàn)cGAS產(chǎn)生的2′3′-cGAMP除可直接激活STING外，也可通過(guò)負(fù)反饋軸介導(dǎo)STING的磷酸化，抑制干擾素應(yīng)答。具體機(jī)制而言，cGAMP可使腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)去磷酸化，去磷酸化的AMPK喪失了對(duì)UNC-51樣激酶(UNC-51-like kinase，ULK1)的抑制作用?；罨腢LK1可磷酸化STING的S366位點(diǎn)，從而抑制STING介導(dǎo)的干擾素應(yīng)答效應(yīng)。值得注意的是，活性抑制的STING將通過(guò)自噬途徑被細(xì)胞降解。

STING的泛素化修飾也參與調(diào)控下游的活性。線粒體E3泛素蛋白連接酶(mitochondrial E3 ubiquitin protein ligase 1，MUL1)可催化STING的K224位點(diǎn)發(fā)生泛素化，STING的泛素化參與調(diào)控IRF3的招募與激活[39]。而阻斷K224位點(diǎn)的泛素化可明顯抑制IRF3介導(dǎo)的干擾素表達(dá)，但不影響NF-κB通路的激活[39]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)使用泛素蛋白特異性蛋白酶13(ubiquitin-specific protease 13，USP13)可使STING去泛素化[40]。去泛素化的STING 招募TBK1的能力大大減弱，從而抑制了炎癥反應(yīng)[40]

3 TBK1的調(diào)控

TBK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并且是STING的關(guān)鍵下游，STING通過(guò)招募TBK1可介導(dǎo)NF-κB、IRF3激活。在經(jīng)典通路中，cGAS-STING-TBK1介導(dǎo)的下游激活更偏重于IRF3通路[41]。但在依托泊苷誘導(dǎo)的核損傷中，共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM) 和干擾素γ誘導(dǎo)因子16(interferon-g-inducible factor 16，IFI16)共同介導(dǎo)STING-TBK-1的激活，此時(shí)的TBK1主要激活的是NF-κB通路[42]。目前，TBK1對(duì)兩種下游的選擇機(jī)制尚不清楚。故在不同方式激活STING的過(guò)程中，抑制TBK1可能會(huì)有不同的效應(yīng)。

據(jù)報(bào)道，BX795是TBK1/IKKε通路強(qiáng)力的抑制劑[43]。也有研究發(fā)現(xiàn)，使用BX795治療原代外周血單核細(xì)胞(來(lái)源于STING基因突變、干擾素效應(yīng)陽(yáng)性的兒童患者)，治療后可明顯抑制IRF3的磷酸化以及干擾素的產(chǎn)生[44]。Mclever等[45]設(shè)計(jì)合成了4-二氨基-5-環(huán)丙基嘧啶，這種分子能夠彌補(bǔ)BX795的部分性能以及激酶選擇性。2019年，Thomson等[46]發(fā)現(xiàn)了GSK8612是一種強(qiáng)效、高選擇性TBK1抑制劑，并且具有較好的細(xì)胞膜穿透性。研究者使用dsDNA或cGAMP刺激THP1細(xì)胞，給予GSK8612治療后可明顯抑制干擾素的產(chǎn)生。值得注意的是，如果長(zhǎng)期使用TBK1抑制劑，可能會(huì)導(dǎo)致抗病毒免疫缺陷，增加感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 語(yǔ)

cGAS-STING通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，阻斷cGAS-STING通路可抑制炎癥反應(yīng)、減輕組織損傷，而激活cGAS-STING通路可促進(jìn)抗病毒、抗腫瘤效應(yīng)。了解cGAS-STING通路各環(huán)節(jié)的調(diào)控機(jī)制，可利用現(xiàn)有的藥物或研發(fā)新藥物干預(yù)cGAS-STING通路，為臨床相關(guān)疾病治療提供新的思路和方法。隨著研究的深入，cGAS下游不依賴STING、STING上游不依賴cGAS以及STING下游不依賴IRF3等非經(jīng)典cGAS-STING通路逐步被發(fā)現(xiàn)，使得關(guān)于該通路的調(diào)控位點(diǎn)的研究更引人入勝。