王 蘭，王 敏，趙黎黎，范志寧，王 翔

0 引 言

內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(endoscopic mucosal resection, EMR)、內(nèi)鏡下黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection, ESD)已被廣泛應(yīng)用于消化道息肉、腺瘤及早癌的治療[1-3]。隨之衍生出的經(jīng)黏膜下隧道內(nèi)鏡腫瘤切除術(shù)(submucosal tunneling endoscopic resection, STER)能夠更微創(chuàng)、有效地切除黏膜下腫瘤[4]。與外科手術(shù)不同，內(nèi)鏡下操作從黏膜層出發(fā)尋找手術(shù)入路。由于消化道黏膜較薄，內(nèi)鏡操作時(shí)間長(zhǎng)，因此內(nèi)鏡治療中存在穿孔、出血、熱損傷等風(fēng)險(xiǎn)[5]。良好的黏膜下注射液形成黏膜下液體墊，充分抬舉病灶，可有效預(yù)防和減少內(nèi)鏡手術(shù)的并發(fā)癥[6]。

海藻酸鈉是一種天然高分子多糖，具有良好的增稠性、穩(wěn)定性和生物相容性[7]。鋰鎂硅酸鹽(laponite)是一種人工合成的來源于無機(jī)物的片狀硅酸鹽，它在攪拌下很容易分散于水中，形成透明無色的高黏度膠體分散液。Laponite具有良好的流變性能，即快速的剪切變稀，因此通常被用作流變學(xué)改性劑及增加劑[8-9]。Pang等[10]以這兩種處理分合成了一種新型的剪切變稀水凝膠，并與等滲鹽水進(jìn)行對(duì)比，證明其可形成良好的黏膜下隆起，有希望成為輔助內(nèi)鏡下腸道息肉精準(zhǔn)切除的新型材料。

在此基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用這兩種組分進(jìn)行濃度優(yōu)化，以透明質(zhì)酸鈉作為對(duì)照，探索其用于胃部黏膜下注射的可行性及有效性，并進(jìn)一步研究其輔助電刀黏膜下剝離術(shù)的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑海藻酸鈉(上海國(guó)藥集團(tuán))，Laponite-XLG(BYK公司)，靛胭脂(上海麥克林公司)，透明質(zhì)酸鈉(上海麥克林公司)，等滲鹽水(上海百特醫(yī)療用品有限公司)、新鮮離體豬胃，離體時(shí)間距實(shí)驗(yàn)時(shí)間不超過12 h。

1.2實(shí)驗(yàn)器械加熱磁力攪拌器(IKA?C-MAG HS 7)、旋轉(zhuǎn)流變儀(MCR302)、ZG30型高頻電刀(威海眾恒醫(yī)療設(shè)備有限公司)、掃描電鏡(S-3400N)、Olympus公司23G鏡下注射針、玻璃攪拌棒、注射器、常規(guī)手術(shù)器械、泡沫板、直尺、游標(biāo)卡尺、計(jì)時(shí)器。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水凝膠的制備海藻酸鈉粉劑中加入去離子水，置于加熱磁力攪拌器40 ℃，1000 r/min攪拌1 h，直至白色固體消失，配置成0.2%的海藻酸鈉水溶液作為原液。將不同劑量的laponite粉末加入原液中，滴入少量0.04%靛胭脂作為染色劑，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，得到laponite濃度為1%、2%、3%、4%、5%的水凝膠。用5 mL注射器對(duì)凝膠進(jìn)行分裝備用。

1.3.2水凝膠的掃描電鏡將適量水凝膠置于-80℃冰箱冷凍過夜后，置于冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥24 h，取出后涂金，掃描電鏡放大觀察。

1.3.3水凝膠注射性及流變性能的測(cè)定用2 mL注射器抽取不同濃度的水凝膠，通過23G內(nèi)鏡下注射針注射，評(píng)估水凝膠的內(nèi)鏡下可注射性。使用旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行黏度測(cè)定、振蕩時(shí)間掃描、振蕩頻率掃描及振蕩應(yīng)變掃描。將水凝膠置于流變儀上下兩塊板之間，將頂板降低至25 mm的間隙距離，并刮掉多余的凝膠，注意使凝膠在頂板和底板之間均勻。在不同應(yīng)變力下測(cè)定了凝膠的黏度。在頻率分別為6.3 rad /s 和0.5%的應(yīng)變下進(jìn)行振蕩時(shí)間掃描。在固定應(yīng)變力為0.5%的條件下行振蕩頻率掃描。以6.3 rad/ s為固定頻率進(jìn)行了振蕩應(yīng)變掃描。儲(chǔ)能模量G′,又稱為彈性模量，是指材料在發(fā)生形變時(shí)，由于彈性(可逆)形變而儲(chǔ)存能量的大小，反映材料彈性大小;損耗模量G″,又稱黏性模量，是指材料在發(fā)生形變時(shí)，由于黏性形變(不可逆)而損耗的能量大小，反映材料黏性大小。儲(chǔ)能模量遠(yuǎn)大于損耗模量時(shí)，材料主要發(fā)生彈性形變，所以材料呈固態(tài)；損耗模量遠(yuǎn)大于儲(chǔ)能模量時(shí)，材料主要發(fā)生黏性形變，所以材料呈液態(tài)；儲(chǔ)能模量和損耗模量相當(dāng)時(shí)，材料為半固態(tài)，凝膠即是一種典型半固態(tài)物質(zhì)。

1.3.4離體豬胃黏膜下注射實(shí)驗(yàn)取新鮮離體豬胃，用大頭針固定在泡沫板上，黏膜下分別注射2 mL的2%、3%、4%、5%的水凝膠，0.4%透明質(zhì)酸鈉和等滲鹽水，重復(fù)5次操作。記錄初始隆起高度。于注射后5、10、15、30、45、60、90、120 min分別測(cè)量黏膜隆起高度，并觀察黏膜隆起隨時(shí)間變化情況。所有實(shí)驗(yàn)均由同一人操作。

維持率=測(cè)量高度÷初始隆起高度×100%

1.3.5離體豬胃黏膜隆起-剝離實(shí)驗(yàn)取新鮮離體豬胃，用大頭針固定在泡沫板上，貼上電極片，用游標(biāo)卡尺標(biāo)記直徑為3 cm的范圍，并用高頻電刀在圓周標(biāo)記至少8個(gè)點(diǎn)，在標(biāo)記范圍內(nèi)黏膜下注射2%、3%、4%水凝膠，0.4%透明質(zhì)酸鈉和等滲鹽水，至標(biāo)記范圍全部隆起后，利用高頻電刀模擬ESD操作，將標(biāo)記范圍內(nèi)黏膜完整剝離，記錄剝離時(shí)間，每組重復(fù)3次。所有實(shí)驗(yàn)均有同一人操作。

2 結(jié) 果

2.1 水凝膠的制備與性能

2.1.1 水凝膠的合成及電鏡1%濃度laponite，可得到透明、無色的膠體分散液。當(dāng)濃度達(dá)到2%時(shí)，攪拌后靜置片刻即成為凝膠。隨著濃度的增高，在5%濃度時(shí)，攪拌后即刻形成高黏度凝膠。電鏡圖像顯示水凝膠形成片層堆疊樣結(jié)構(gòu)。見圖1 。

2.1.2水凝膠的可注射性不同濃度的水凝膠均可通過1、2、5 mL的注射針頭注射，且可順利通過23G內(nèi)鏡下注射針注射，注射后立刻轉(zhuǎn)化為固態(tài)凝膠。但是，隨著laponite濃度的增加，注射阻力逐漸增大。

圖 1 水凝膠的掃描電鏡圖

2.1.3水凝膠的流變性能在laponite濃度2%～5%范圍內(nèi)，黏度測(cè)量顯示凝膠的黏度隨著濃度的增加而增加；隨著剪切速率的增加，黏度逐漸下降。振蕩測(cè)試表明，水凝膠的儲(chǔ)存模量(G′)和損耗模量(G″)隨濃度增加而增加。頻率掃描顯示，在頻率0.1～100 rad/s 掃描過程中,水凝膠的G′值和G″值較為穩(wěn)定，且G′大約是G″的10～20倍。上述結(jié)果說明形成了穩(wěn)定的水凝膠。進(jìn)一步進(jìn)行了應(yīng)變相關(guān)的振蕩流變學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在0.01～10左右的應(yīng)變力下水凝膠表現(xiàn)為線性粘彈性，當(dāng)超過臨界應(yīng)變力時(shí)，凝膠的G′隨著應(yīng)力的增加而減小，表明凝膠發(fā)生了凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變，而呈現(xiàn)液體狀態(tài)。G′和GG″的交點(diǎn)則是由凝膠向液態(tài)的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。見圖2。

2.2離體豬胃黏膜隆起效果評(píng)價(jià)

2.2.1 初始隆起高度在離體豬胃注射相同劑量的黏膜下注射劑(2 mL)，2%～5%濃度水凝膠的初始隆起高度分別為[(8.70±0.57)、(9.60±0.89)、(10.10±0.74)、(9.50±1.41)mm]，均大于等滲鹽水[(5.20±0.76)mm]和透明質(zhì)酸鈉[(7.40±0.74)mm]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 隨著laponite濃度的增高，其平均隆起高度逐漸增加，當(dāng)濃度增加至4%時(shí)，其平均隆起高度達(dá)到最大值，與2%濃度的隆起高度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.2離體豬胃黏膜隆起高度變化等滲鹽水處理后黏膜隆起高度隨時(shí)間變化最快，透明質(zhì)酸鈉次之，水凝膠最為緩慢、穩(wěn)定。在60 min時(shí)，等滲鹽水處理的隆起高度維持率不足25%，透明質(zhì)酸組的隆起高度維持率約為46%，而不同濃度水凝膠(2%～5%)的隆起維持率高達(dá)72%～83%。即使在2 h后，最低濃度(2%)水凝膠組的隆起維持率仍然維持在70%以上。在5、10、15、30、45、60 min時(shí)，2%～5%水凝膠的黏膜隆起高度均明顯高于同時(shí)間點(diǎn)等滲鹽水和透明質(zhì)酸鈉(P<0.05)。

不同濃度水凝膠相比較，注射2%水凝膠黏膜2 h隆起高度[(6.20±0.84)mm]低于3%、4%和5%水凝膠[(7.70±0.45)、(8.40±0.84)、(7.80±1.30)mm],但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3離體豬胃黏膜隆起后電刀剝離效果評(píng)價(jià)注射2%、3%、4%水凝膠后隆起的平均剝離時(shí)間[(6.12±0.16)、(4.50±0.51)、(3.09±0.70)min]兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且均較等滲鹽水[(7.97±0.42)min]和透明質(zhì)酸鈉[(6.92±0.39)min]明顯減少(P<0.05)。

a:不同剪切速率下水凝膠的黏度值 ；b:水凝膠的振蕩頻率掃描，以0.5%應(yīng)力掃描; c:水凝膠的振蕩應(yīng)變掃描，以6.3 rad/s掃描；d:水凝膠的振蕩時(shí)間掃描，以0.5%應(yīng)力和6.3 rad/s掃描

表 1 不同黏膜下注射劑黏膜隆起高度隨時(shí)間的變化情況

3 討 論

EMR、ESD等內(nèi)鏡下切除術(shù)可早期、微創(chuàng)地治療消化道息肉、癌前病變及早癌，阻斷其進(jìn)一步發(fā)展成為消化道腫瘤。與EMR相比，ESD可應(yīng)用于更大的黏膜病灶，將病變黏膜整塊剝除，獲得更完整的病理組織，其治療效果與外科手術(shù)相當(dāng)[11-13]。但是，在內(nèi)鏡操作中也存在出血、穿孔、熱損傷等并發(fā)癥[5]。因此各種類型的黏膜下注射液被提出且應(yīng)用于臨床實(shí)踐。注射黏膜下注射液抬高病變將其與肌層分離，形成一個(gè)液體緩沖墊，從而減少熱損傷、出血、穿孔等并發(fā)癥；同時(shí)提高技術(shù)可行性，促進(jìn)整塊剝離[14-15]。黏膜下注射液對(duì)于大部分內(nèi)鏡切除術(shù)是必不可少的，尤其是分片EMR和ESD治療，常常需要維持時(shí)間更久的黏膜下注射液[14-16]。ESGE指南指出，對(duì)于直徑10 mm以上的息肉冷切除也建議黏膜下注射等滲鹽水[17]。但是目前臨床上使用何種黏膜下注射液效果更佳尚未達(dá)成一致共識(shí)。理想的黏膜下注射液應(yīng)可提供較厚且維持時(shí)間久的黏膜下液體墊，易于注射，價(jià)格低廉，具有良好的生物相容性[6, 15]。

等滲鹽水是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛地黏膜下注射液，其優(yōu)點(diǎn)在于價(jià)格低廉，等滲無毒；缺點(diǎn)是可迅速被周圍組織吸收，黏膜下液體墊薄且維持時(shí)間短，在手術(shù)操作過程中需反復(fù)大量注射[15]。其他黏膜下注射劑如高滲鹽水、高滲葡萄糖、羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸鈉、自體血液、纖維蛋白原等均被臨床應(yīng)用研究，但是這些注射液依然存在生物相容性、安全性、維持時(shí)間的限制[18-22]。具體來說，高滲鹽水、高滲葡萄糖的黏膜下液體墊在30 min內(nèi)維持率不到50%[19]；注射羥丙基甲基纖維素存在抗原反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，而且由于其高黏度，通過內(nèi)鏡下注射針阻力較大[19]；透明質(zhì)酸鈉可刺激殘留腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]；自體血液及纖維蛋白原可增加感染風(fēng)險(xiǎn)[21]。在本研究中，我們以臨床應(yīng)用較為廣泛且效果優(yōu)于等滲鹽水的透明質(zhì)酸鈉作為對(duì)照組。

與等滲鹽水相比，滲透壓和黏度是其他液體溶液的關(guān)鍵缺點(diǎn)，高滲透壓可能導(dǎo)致組織脫水和損傷，而黏度是通過長(zhǎng)內(nèi)鏡通道給藥困難的原因。水凝膠是一種具有較好吸水性及硬度的材料，可形成持久的黏膜下液體墊而不向周圍組織擴(kuò)散[23]。但是，傳統(tǒng)的水凝膠通過化學(xué)鍵或物理作用力形成，通常不可通過內(nèi)鏡下注射針[24]。一些原位合成的水凝膠已被廣泛應(yīng)用于臨床研究，但是由于需同時(shí)注射多種組分，對(duì)于內(nèi)鏡下注射仍然存在挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，laponite單晶體是一種表面帶負(fù)電荷，周圍帶正電荷的八面體結(jié)構(gòu)；因此將laponite在陰離子海藻酸鹽溶液中分散時(shí)，由于正負(fù)電荷作用，形成了具有剪切變稀作用的凝膠，即在高剪切力作用下凝膠成為流體，剪切后快速恢復(fù)凝膠結(jié)構(gòu)[9, 25]。這種剪切變稀性能，可輔助水凝膠經(jīng)長(zhǎng)內(nèi)鏡通道給藥，且黏膜下注射后仍可形成持久的黏膜下墊。

Pang等[10]已利用該特性，合成了濃度為2～4 mg/mL的水凝膠，并與等滲鹽水進(jìn)行對(duì)比，應(yīng)用于離體豬腸道黏膜下注射，結(jié)果表明其隆起效果及維持時(shí)間明顯優(yōu)于等滲鹽水，可用于輔助腸道息肉的精準(zhǔn)切除。但是，胃黏膜的厚度明顯大于腸道黏膜，而且對(duì)于胃部>2 cm的病變，需要形成更持久穩(wěn)定的黏膜下液體墊。因此，本研究利用這一特性，合成了濃度為20～50 mg/mL的水凝膠，通過對(duì)離體豬胃黏膜下注射不同濃度的水凝膠，觀察黏膜下隆起的高度及隨時(shí)間的變化發(fā)現(xiàn)，在60 min時(shí)，等滲鹽水組的隆起高度維持率不足25%，透明質(zhì)酸組的隆起高度維持率約為46%，而不同濃度水凝膠(2%～5%)的隆起維持率高達(dá)72%～83%。證明該水凝膠具有持久有效地隆起效果；且注射相同劑量的水凝膠與等滲鹽水、透明質(zhì)酸鈉相比，隆起高度有明顯優(yōu)勢(shì)，表明我們可能僅僅需要很少量的水凝膠即可獲得持久有效的黏膜下液體墊，避免多次重復(fù)注射，也彌補(bǔ)了水凝膠價(jià)格高于等滲鹽水的不足。

此外，我們認(rèn)為內(nèi)鏡黏膜下注射材料一方面要具備良好的黏膜下隆起效果，另一方面需輔助電刀切割效率，只有同時(shí)滿足這兩方面因素，才可最終應(yīng)用于實(shí)際臨床內(nèi)鏡下治療。目前臨床上ESD常規(guī)使用的是單極刀，其原理是高頻電流從電刀刀頭導(dǎo)出，通過人體組織及粘液，再到達(dá)體表的接地墊，返回電流發(fā)生器。因此黏膜下注射劑需要有一定的導(dǎo)電率，從而不影響電刀切割效率。電導(dǎo)率測(cè)定發(fā)現(xiàn)等滲鹽水的電導(dǎo)率約為6030 μs/cm，0.4%透明質(zhì)酸鈉為724 μs/cm，2%～5%水凝膠電導(dǎo)率分為為2242、3186、3656、4128 μs/cm。最后，我們使用單極電刀在離體豬胃上模擬ESD操作，我們發(fā)現(xiàn)注射水凝膠后形成的黏膜下墊可充分地將黏膜層及肌層分離，且不影響切割效率，明顯縮短了ESD的操作時(shí)間。

本研究通過離體豬胃黏膜下注射及模擬ESD剝離術(shù)驗(yàn)證了剪切變稀水凝膠應(yīng)用于胃部黏膜下注射的可行性及有效性。但是，本研究也存在一些不足之處：①隨著laponite濃度的提高，水凝膠的黏度逐漸增大，注射阻力也會(huì)相應(yīng)增大，因此，需要進(jìn)一步阻力評(píng)估來確定合適的內(nèi)鏡下注射濃度；②本文中采用新鮮離體豬胃來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，由于條件限制，未進(jìn)行活體豬胃ESD術(shù)；③雖然laponite和海藻酸鹽均具有良好的安全性及生物相容性，但是由于水凝膠的三維立體結(jié)構(gòu)，可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)散，因此需要進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)期觀察其安全性和生物相容性。我們下一步將進(jìn)行家兔以及活體豬實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步確定合適的水凝膠濃度，評(píng)估其在活體的黏膜下隆起效果及對(duì)ESD操作的影響，以及是否具有止血促愈合作用，觀察其安全性及生物相容性。