宋慧琴,張君娜

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科, 河南 開封 475000)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率分別占惡性腫瘤的第4位和第3位[1]。近20年來，結(jié)直腸癌在西方發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率呈明顯下降趨勢(shì)；但隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，國(guó)民飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣改變及人口老齡化進(jìn)程加快等原因，結(jié)直腸癌在我國(guó)呈升高趨勢(shì)[2]。最新數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病例數(shù)為37.63萬人，因結(jié)直腸癌死亡患者19.10萬人，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率均位于我國(guó)惡性腫瘤前5位[3-4]，給我國(guó)人民生命健康帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。但結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，因此，早診、早治成為結(jié)直腸癌防治和預(yù)后的關(guān)鍵。Septin 9基因是結(jié)直腸癌發(fā)生中重要的抑癌基因[5]，本文研究Septin 9基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般臨床資料

收集我院2018年1月～2019年1月結(jié)直腸癌組織標(biāo)本60例，均經(jīng)手術(shù)切除，取自結(jié)直腸癌組織病灶中心，其中男36例，女24例；年齡37～80歲，平均年齡(56.5±13.5)歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期17例；組織分化程度：低中分化49例，高分化11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0-152例，N2 8例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：M0 47例，M1 13例。選取同期在我院體檢的結(jié)直腸良性病變(介質(zhì)腸炎、息肉)組織標(biāo)本30例作為對(duì)照組，均經(jīng)手術(shù)切除，取自正常腸組織標(biāo)本邊緣，其中男15例，女15例；年齡35～80歲，平均年齡(55.7±14.2)歲。兩組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有臨床可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：首次診斷，既往未接受手術(shù)、放療或化療等治療者；患者均完全知情并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位惡性腫瘤者；合并糖尿病、高血壓、心臟病等疾病者。

1.3 儀器與試劑

TRIzol DNA提取試劑盒(美國(guó)Thermo-Fisher公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen Biotech公司)；NanoDrop 2000C核酸蛋白分析儀(美國(guó)Thermo-Fisher公司)；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；anti HIF-1α抗體(美國(guó)abcam公司)；蛋白提取試劑盒、二抗(北京中山金橋生物科技公司)；聚偏氟乙烯膜(美國(guó)Millipore)。

1.4 方法

1.4.1RT-PCR法檢測(cè)Septin 9 mRNA、HIF-1α mRNA表達(dá) 取患者空腹靜脈血10mL，3000rpm/min離心10 min，分離得血漿，TRIzol法提取組織RNA，核酸蛋白分析儀評(píng)估RNA質(zhì)量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃×5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃×25 s、62 ℃×40 s,65℃×30 s，10個(gè)循環(huán)；93℃×25 ℃，58 ℃×40 s，65 ℃×30 s，21個(gè)循環(huán)；65℃×10 min，1個(gè)循環(huán)；產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內(nèi)參。采用Bio-Rad軟件分析條帶灰度值，目的RNA表達(dá)量=目的RNA灰度值/GAPDH灰度值。Septin 9上游引物：ATTCGTTGTGTATT AGTTATTAT，下游引物：GCAACAACCAACCCAAC；HIF-1α上游引物：5′-TGCATCTCCACCTTCTACCC-3′，下游引物：5′-CTGCTCCATTCCATCCTGTT-3′。GAPDH上游引物：5′-CAAGGCTGAGAACGGGAAGC-3′，下游引物：5′-GATGACCCTTTTGGCTCCCC-3′。

1.4.2Western bloting法檢測(cè)Septin9蛋白和HIF-1α蛋白水平 采用蛋白提取試劑盒提取結(jié)直腸癌病灶蛋白，10% SDS-PAGE凝膠電泳，室溫下，5%脫脂奶中封閉2 h，加入抗HIF-1α抗體(1∶1000)，4℃過夜，0.1% TBS-Tween-20中洗滌，加入兔抗IgG二抗，室溫下孵育1h，采用Chemi DocTM MP系統(tǒng)對(duì)印跡進(jìn)行掃描，使用Image J1.51軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。以β-actin為內(nèi)參照，采用目標(biāo)蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值代表該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者與對(duì)照組患者Septin 9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表達(dá)水平對(duì)比

兩組患者Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)直腸癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.2 結(jié)直腸癌患者Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表達(dá)水平與臨床資料相關(guān)性

不同性別、年齡結(jié)直腸癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNM Ⅲ～Ⅳ期患者的水平顯著高于TNM Ⅰ～Ⅱ期患者，高分化患者的表達(dá)水平顯著高于低中表達(dá)患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N2級(jí)患者顯著高于N0-1患者，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M1患者顯著高于M0患者。見表2。

表1 結(jié)直腸癌患者與對(duì)照組患者Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表達(dá)水平對(duì)比

表2 結(jié)直腸癌患者Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表達(dá)水平與臨床資料相關(guān)性

2.3 Septin9蛋白與HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：Septin9蛋白表達(dá)水平與HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.286，P<0.001；r=0.213，P<0.001)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)逐漸發(fā)展的復(fù)雜生物學(xué)過程，而原癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的根本原因。其中抑癌基因是一類可抑制細(xì)胞增殖從潛在抑制癌變作用的基因，在正常生理?xiàng)l件下，抑癌基因通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，或抑制細(xì)胞周期等對(duì)細(xì)胞內(nèi)增殖信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，防止細(xì)胞異常增殖，從而實(shí)現(xiàn)抑制癌癥的功能[6]。

Septin基因是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，在人類細(xì)胞中由14個(gè)家族成員組成，即SEPT1～14，其中Septin9定位于17q25.3，有多個(gè)亞型(Septin 9-v1、v2、v3、v4)，結(jié)構(gòu)上由位于中央的p-loop GTP結(jié)合域、可變的N端和C端結(jié)構(gòu)域組成，與DNA修復(fù)、遷移、凋亡等細(xì)胞功能有關(guān)[7-8]。目前研究認(rèn)為，Septin9基因主要通過CpG島甲基化參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程，Septin9甲基化一方面使其自身構(gòu)象發(fā)生變化，不利于轉(zhuǎn)錄因子與基因的結(jié)合，空間上抑制了基因的表達(dá)[9]，另一方面甲基化后招募并結(jié)合甲基化CpG結(jié)合域蛋白(MBDS)，MBDS并招募其他蛋白質(zhì)，形成不活躍的異常染色質(zhì)，從而抑制基因的表達(dá)[10]?；谘獫{Septin9甲基化檢測(cè)試劑盒已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌早期篩查，其檢出結(jié)直腸癌的敏感性為79.3%(1/3算法)～95.6%(2/3算法)，特異性為84.8%(1/3算法)～99%(2/3算法)[11-12]。

同時(shí)，諸多研究表明，Septin9還可以通過HIF-1通路、Rho途徑、JNK通路等多種信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。HIF-1是細(xì)胞缺氧狀態(tài)下廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由HIF-1α和HIF-1β亞單位構(gòu)成，低氧環(huán)境下，HIF-1α不能迅速生成和降解，只能與HIF-1β形成異二聚體，并與目標(biāo)基因DNA啟動(dòng)子序列的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，通過多種信號(hào)通路激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄基因，促進(jìn)腫瘤生存和增殖；當(dāng)缺氧狀態(tài)得到改善時(shí)，HIF-1α被迅速降解。而缺氧是實(shí)體瘤生長(zhǎng)的重要特征，因此，研究認(rèn)為HIF-1α在血管生成、細(xì)胞增殖、能量代謝、細(xì)胞黏附等相關(guān)基因的調(diào)控方面占據(jù)重要地位[14]。

本文研究發(fā)現(xiàn)：結(jié)直腸癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；結(jié)直腸癌患者的Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表達(dá)水平與性別、年齡無關(guān)，而與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)相關(guān)，TNM III～I(xiàn)V期患者的水平顯著高于TNM I～I(xiàn)I期患者，高分化患者的表達(dá)水平顯著高于低中表達(dá)患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N2級(jí)患者顯著高于N0-1患者，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M1患者顯著高于M0患者。Septin9蛋白表達(dá)水平與HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.286，P<0.001；r=0.213，P<0.001)。上述結(jié)果說明Septin9 mRNA、Septin9蛋白、HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可能機(jī)制為Septin9蛋白高表達(dá)抑制HIF-1α泛素化降解途徑，從而促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15-16]。

Septin9基因在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，闡明其在結(jié)直腸癌中表達(dá)情況及生物學(xué)功能，使其成為結(jié)直腸癌基因治療的理想靶點(diǎn)，正受到越來越多關(guān)注