趙小亞,江如鈔,肖青*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣東省分子靶標(biāo)與臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，廣東 廣州 511436)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一種能夠形成血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，亦稱為成血管細(xì)胞，對心血管疾病中內(nèi)皮損傷的修復(fù)從而改善血管功能起著重要的作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞在修復(fù)與更新過程中遷移至受損血管處，通過分化成為功能性內(nèi)皮細(xì)胞，并通過分泌促血管因子改善受損內(nèi)皮細(xì)胞的再生從而有效促進(jìn)內(nèi)皮功能恢復(fù)，維持血管的穩(wěn)態(tài)[1, 2]。相關(guān)動物和臨床實(shí)驗(yàn)都證明EPCs對血管的再生具有重要的作用。在大鼠心肌梗死模型中，心肌內(nèi)轉(zhuǎn)移外周血來源的EPCs，促進(jìn)內(nèi)皮再生和新生血管形成，改善左心室功能[3]，在缺血性心力衰竭患者中阿托伐他汀治療通過調(diào)動和提高外周血循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量促進(jìn)內(nèi)皮功能的修復(fù)[4]。由此可見，EPCs在內(nèi)皮細(xì)胞的生成和維持內(nèi)皮完整性方面具有重要作用，可應(yīng)用于缺血性疾病的治療。但是，在糖尿病階段，EPCs的動員數(shù)量明顯減少、功能受損，導(dǎo)致血管修復(fù)能力下降，降低如受損傷口的愈合和缺血組織中血管側(cè)支的形成，大大增加糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病率與死亡率[5, 6]。

Sonic hedgehog(Shh)是一種分泌蛋白屬于Hedgehog(Hh) 家族的重要成員，在缺血損傷中可通過激活Shh信號通路促進(jìn)血管新生和損傷組織的修復(fù)。在缺血模型中轉(zhuǎn)染Shh基因，可促進(jìn)血管新生，產(chǎn)生對缺血心肌的修復(fù)作用[7]。而在糖尿病動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，Shh信號可以明顯改善糖尿病的血管病變。給予Shh蛋白治療，可以通過誘導(dǎo)動脈生成和調(diào)節(jié)神經(jīng)血流量明顯地改善糖尿病引起的神經(jīng)血管病變[8]。我們之前的研究證明，糖尿病EPCs的Shh信號通路中Ptch和Gli的表達(dá)下調(diào)，說明該通路受損，給予Shh信號激動劑SAG后，糖尿病EPCs的功能包括增殖、遷移、粘附、小管形成能力得到明顯的改善，從而改善1型糖尿病小鼠后肢缺血損傷[9]，然而，激活Shh通路改善糖尿病EPCs功能的作用機(jī)制尚不明確?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)超家族是鋅依賴性內(nèi)肽酶幾乎能夠降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括20多種蛋白酶成員，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。研究證明，抑制MMP2的表達(dá)阻礙EPCs的小管形成能力[10]。那么Shh通路改善糖尿病EPCs功能是否與MMP2有關(guān)，目前尚不清楚。因此本研究通過基因修飾激活Shh通路，探討其對糖尿病EPCs功能的改善，并明確改善作用的機(jī)制，為糖尿病合并心血管疾病的治療提出新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF近交系C57BL/6雄鼠，6～8周齡，平均體質(zhì)量(20±2)g，來源于廣東省醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

EGM-2培養(yǎng)基購自美國Lonza公司；M199培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購自美國Gibco公司；Shh蛋白購自美國R&D公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；Matrigel膠、人纖維粘連蛋白購自美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1建立1型糖尿病小鼠模型 將6～8周C57BL/6雄鼠隨機(jī)分為注射STZ糖尿病組與檸檬酸緩沖液對照組，糖尿病組連續(xù)5 d給予禁食的小鼠腹腔注射小劑量鏈佐霉素STZ 45 mg/kg/d，對照組給予等量的檸檬酸緩沖液。STZ注射結(jié)束后第三天，當(dāng)小鼠隨機(jī)血糖高于16.7 nmol/L，說明成功建立糖尿病小鼠模型。

1.3.2骨髓EPCs的分離培養(yǎng) 糖尿病小鼠經(jīng)麻醉后脫頸處死,無菌解剖分離四肢長骨，M199培養(yǎng)基反復(fù)輕緩沖洗骨髓腔，將骨髓細(xì)胞全部沖洗到培養(yǎng)皿中。用槍頭將細(xì)胞團(tuán)吹打分散，收集到15 mL無菌離心管中，4 ℃條件下400 g(1 300 RPM)離心20 min。倒掉上清液，剩下細(xì)胞沉淀，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，用槍頭吹打均勻，放置1 min，使紅細(xì)胞充分裂解，加入6 mLPBS離心洗滌2次。加適量EGM培養(yǎng)基混懸細(xì)胞，分種于包有纖連蛋白的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，其中每隔三天全量換液一次。

1.3.3EPCs遷移實(shí)驗(yàn) 0.25%胰酶消化收集貼壁細(xì)胞，EBM培養(yǎng)基混懸細(xì)胞，將100 μL的5×105/mL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室、下室加入500 μL含10%FBS的EBM培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，移去上室培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，PBS沖洗3遍，用棉簽?zāi)ㄈranswell小室上室內(nèi)膜上面未遷移的細(xì)胞。下室上表面用甲醇室溫固定20 min，于37 ℃暖箱中，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS多次沖洗晾干，在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，選取相同的5個視野計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)量。

1.3.4EPCs 小管形成實(shí)驗(yàn) 48孔培養(yǎng)板每孔緩慢加入200μL Matrigel膠，避免氣泡的產(chǎn)生，之后將其放置37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。每孔加入400 μL EBM培養(yǎng)基細(xì)胞懸液，輕拍使細(xì)胞均勻分布，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，40倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 糖尿病EPCs的鑒定

從糖尿病模型8～12周的小鼠中分離出骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)，于第七天先后給予Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)與FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)各孵育1 h，激光共聚焦觀察EPCs攝取染料的情況。如圖1顯示，EPCs同時攝取FITC-UEA-1和DiL-acLDL，顯示雙熒光陽性(橙黃色)的細(xì)胞則被認(rèn)為是EPCs。

圖1 激光共聚焦鑒定糖尿病小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(×200)

2.2 Adv-Shh轉(zhuǎn)染糖尿病EPCs的最佳滴度選擇

已知Adv-Shh滴度為2.0×1010pfu/mL，糖尿病EPCs以1×107、2×107、4×107、1×108滴度轉(zhuǎn)染Shh腺病毒12 h后繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。圖2顯示，滴度為1×107、2×107、4×107的轉(zhuǎn)染效率明顯低于滴度為1×108；圖3顯示，與Adv-GFP組相比，腺病毒以滴度1×108過表達(dá)Shh組的Shh 表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，過表達(dá)效率達(dá)18.79倍。

2.3 糖尿病EPCs的小管形成與遷移能力

糖尿病EPCs以滴度為1×108的Adv-Shh轉(zhuǎn)染12 h后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，用Matrigel建立小管形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)算形成的管腔長度。用Transwell小室建立遷移實(shí)驗(yàn)，計(jì)算遷移至下室表面的細(xì)胞數(shù)。圖4A顯示，與Adv-GFP組相比，Adv-Shh組的糖尿病EPCs小管形成能力明顯增加(P<0.05)。圖4B顯示，與Adv-GFP組相比，Adv-Shh組的糖尿病EPCs遷移數(shù)量明顯增加(P<0.05)。

2.4 Sonic hedgehog通路激活糖尿病EPCs的MMP2和Gli1蛋白表達(dá)

糖尿病EPCs給予Shh蛋白(0.5 μg/mL)作用24 h后檢測MMP2、Gli1的表達(dá)，結(jié)果顯示，給予Shh蛋白后，其下游蛋白Gli1表達(dá)明顯上調(diào)，說明Shh通路被活化。圖5顯示，與正常對照組相比，糖尿病EPCs中MMP2、Gli1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，給予Shh蛋白處理后，MMP2、Gli1的表達(dá)明顯回升(P<0.05)。

圖2 熒光成像技術(shù)觀察糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(×100)

圖3 Western blot 檢測糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞Shh蛋白表達(dá)水平(*P<0.05, n=3)

2.5 小分子MMP2-siRNA沉默效率的檢測

糖尿病EPCs給予MMP2-siRNA轉(zhuǎn)染6 h后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，以加入NC-siRNA作為陰性對照組，以轉(zhuǎn)染MMP2-siRNA-1, 2, 3作為實(shí)驗(yàn)組(siRNA序列分別為：siRNA-1：GGAATGCCA TCCCTGATA；siRNA-2：CCACAACCAACTACGATGA；siRNA-3：TGAGAAGGATGGCAAGTAT)。圖6顯示，與陰性對照組比較，siRNA-1和siRNA-2均可顯著減少M(fèi)MP2蛋白表達(dá)水平，其中siRNA-2抑制效果最顯著(P<0.05)。

圖4 糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞小管形成與遷移能力檢測4A小管形成；4B 遷移能力(*P<0.05, n=3)

圖5 Sonic hedgehog通路激活上調(diào)糖尿病內(nèi)皮組細(xì)胞MMP2和Gli1蛋白表達(dá)(*P<0.05, n=3)

2.6 干擾MMP2表達(dá)抑制Shh通路對糖尿病EPCs的MMP2、小管形成與遷移能力的改善

給予MMP2-siRNA-2轉(zhuǎn)染6 h后換為完成培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，給予Shh蛋白(0.5 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。圖7顯示，MMP2-siRNA-2顯著抑制糖尿病EPCs 中Shh蛋白引起的MMP2表達(dá)增加(P<0.05)。圖8顯示，給予Shh蛋白(0.5 μg/mL)顯著增加糖尿病EPCs的小管形成和遷移能力，而在此基礎(chǔ)上給予MMP2-siRNA-2明顯抑制Shh蛋白對EPCs功能的改善(P<0.05)。

圖6 siRNA-1和siRNA-2減少M(fèi)MP2蛋白表達(dá)水平(*P<0.05, n=3)

圖7 干擾MMP2表達(dá)抑制Shh通路引起的糖尿病內(nèi)皮組細(xì)胞MMP2表達(dá)上調(diào)(*P<0.05, n=3)

圖8 干擾MMP2表達(dá)抑制Shh通路對糖尿病內(nèi)皮組細(xì)胞小管形成與遷移能力的改善(*P<0.05, n=3)

3 討論

EPCs存在于骨髓和體循環(huán)中，可分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與血管新生，又可以整合到內(nèi)皮表層，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和功能的活化。因此，EPCs在缺血組織中參與血管的新生，對缺血引起的損傷具有重要的改善作用。然而，EPCs的數(shù)量與其功能的穩(wěn)定是維持其血管新生作用的關(guān)鍵因素。在糖尿病的病理狀態(tài)下時，EPCs的循環(huán)數(shù)量減少，功能受損，對刺激反應(yīng)的敏感性降低；旁分泌行為異常，主要表現(xiàn)為失去分泌促血管因子的能力，分泌抗血管因子。為了證明EPCs在糖尿病模型中是否受損，我們通過小劑量多次注射鏈脲佐菌素(STZ)建立小鼠1型糖尿病模型，8周后分離骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)，用小管形成及遷移實(shí)驗(yàn)證明，與正常小鼠相比糖尿病EPCs的小管形成和遷移能力明顯下降[9]，這些結(jié)果表明在糖尿病中，EPCs的功能明顯下降，這與之前的相關(guān)研究相一致[11-12]。

Sonic Hedgehog(Shh)在胚胎時期對血管的形成有直接的導(dǎo)向作用，在成年時期對心血管功能的維持和損傷后的修復(fù)具有重要，激活Shh信號通路可以促進(jìn)缺血組織的血管新生。已有研究顯示，Shh信號可以促進(jìn)多種干細(xì)胞的增殖分化，如間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、CD34+等，因此可參與組織損傷的細(xì)胞填充及血管新生。最近，我們的研究表明，糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞中的Shh、Ptch和Gli的表達(dá)下調(diào)，而給予Shh通路激動劑能顯著改善糖尿病EPCs功能障礙，為了進(jìn)一步證明激活Shh通路是否改善糖尿病EPCs的功能，本研究使用Adv-Shh對骨髓分離培養(yǎng)的糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，以期望觀察Shh基因修飾過后的糖尿病EPCs的受損功能得到改善。首先驗(yàn)證腺病毒過表達(dá)效率，以滴度為1×108的腺病毒Adv-Shh感染內(nèi)皮祖細(xì)胞，結(jié)果顯示Shh表達(dá)明顯增加，提示其對Shh通路具有顯著激動作用。隨后，采用小管形成與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證明EPCs的功能，結(jié)果顯示，Shh基因修飾的EPCs與對照組相比，其小管形成與遷移能力得到明顯的改善，說明Shh基因修飾的糖尿病EPCs的功能得到顯著改善。

新血管的形成與胞外蛋白水解作用緊密相關(guān)，而大部分相關(guān)的細(xì)胞外蛋白水解酶屬于兩大家族，其中包括基質(zhì)蛋白酶家族，MMP2是基質(zhì)蛋白酶(MMPs)家屬中的一種明膠酶A，與血管的新生密切相關(guān)[13]。在EPCs中，血管生長因子(VEGF)可以刺激MMP2的分泌與激活，特定的抑制或者基因消除MMP2的表達(dá)阻礙了內(nèi)皮祖細(xì)胞的小管形成[14]。但在糖尿病EPCs中，MMP2的表達(dá)如何，以及是否與糖尿病EPCs功能相關(guān)還未可知。本研究結(jié)果顯示，糖尿病EPCs中的MMP2表達(dá)下降，給予Shh蛋白可以促進(jìn)MMP2蛋白表達(dá)，小分子RNA干擾MMP2表達(dá)翻轉(zhuǎn)Shh蛋白對MMP2的激動作用。本研究還進(jìn)一步證明干擾MMP2表達(dá)抑制Shh蛋白對糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞小管形成和遷移的提高，說明Shh-MMP2通路受損與糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。

綜上所述，激活Shh通路通過MMP2改善糖尿病EPCs功能受損，為發(fā)展糖尿病患者自體細(xì)胞療法提供新治療靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。